该说明书方法适用于本公司提取的猪原代肝细胞，您使用时，请按随货的说明书操作，如有任何疑问可咨询公司技术人员。

I 简介

立沃生物科技是一家专注于原代肝细胞分离、冻存与再生的国家高新技术企业。猪原代肝细胞分离自清洁或者SPF级比猪，细胞纯度高（>95%），经过多种测试，复苏后细胞活力高、极化（分化）形态明显，可广泛应用于基础生命科学研究以及药物研发中。

II  试剂与材料

-猪原代肝细胞（Cat# LV-PPH001）           

-复苏培养基（Cat#LV-Rec001）

-纯化培养基（如需要，随细胞赠送）                     

-铺板培养基（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-WEP002）

-维持培养基（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-WEM002）                   

-胶原包被板（贴壁肝细胞需要，Cat#LV-Coated）

-无菌15ml离心管                               

-一次性移液管

-宽口移液枪头（普通移液枪头剪去尖头，再灭菌）

-移液枪

-恒温水浴锅（37℃预热，请用温度计校准）                      

-水平冷冻离心机（带水平转子，可离15ml离心管）

-生物安全柜                                   

-37℃/5%CO2培养箱

-75%酒精

III 悬浮细胞的复苏

1.        生物安全柜中，将10ml复苏培养基加入到15ml离心管中，37℃恒温水浴锅预热20min，然后转移到生物安全柜中；铺板培养基37℃预热。

2.        将冻存的肝细胞从冷藏位置迅速转移至37℃恒温水浴锅中，尽可能多的浸入37℃水中，顺时针水平摇动，但必须确保冻存管管盖保持在水面以上。

3.        解冻冻存管约90 ~120s，至冻存管中只有小块碎冰漂浮即可。

4.        用75%酒精消毒冻存管，并将其转移到生物安全柜。

5.        用宽口枪头将细胞吸出，并以滴加方式转移至含已预热的复苏培养基的离心管中（注意：冻存管与枪头上残留细胞，可吸取1ml复苏培养基清洗冻存管与枪头并将其混入离心管的培养基中），轻微上下颠倒离心管2-3次混匀。

6.        用台盼蓝排除法测定肝细胞的活力、活细胞数。按照实验要求加入药物，测定药物代谢情况。

7.        如细胞密度达不到要求或者担心冻存液对代谢酶活性有影响，可直接低速离心（离心对细胞活力有一定的影响），50×g，常温离心5min。去上清，用药物代谢专用培养基（客户自备）重悬，用台盼蓝排除法测定肝细胞的活力、活细胞数。按照实验要求加入药物，测定药物代谢情况。

IV 贴壁细胞的复苏与铺板

1.      生物安全柜中，将10ml复苏培养基加入到15ml离心管中，37℃恒温水浴锅预热20min，然后转移到生物安全柜中；纯化培养基常温放置（如需要）；铺板培养基37℃预热。

2.      将冻存的肝细胞从冷藏位置迅速转移至37℃恒温水浴锅中，尽可能多的浸入37℃水中，顺时针水平摇动，但必须确保冻存管管盖保持在水面以上。

3.      解冻冻存管约90-120s，至冻存管中只有小块碎冰漂浮即可。

4.      用75%酒精消毒冻存管，并将其转移到生物安全柜。

5.      用宽口枪头将细胞吸出，并以滴加方式转移至含已预热的复苏培养基的离心管中（注意：冻存管与枪头上残留细胞，可吸取1ml复苏培养基清洗冻存管与枪头并将其混入离心管的培养基中），轻微上下颠倒离心管2-3次混匀。

6.     可直接低速离心，50×g，常温离心5min。更优选方案是：常温放置30-45min后（每15min轻轻颠倒混匀一次），再进行低速离心（50×g，常温离心5min）。

7.      去上清，用4ml铺板培养基重悬，用台盼蓝排除法测定肝细胞的活力，若活力>70%，可直接铺板，反之则需进行纯化。

8.     细胞纯化：将细胞悬液离心，50×g，常温离心5min，去上清，用2ml纯化培养基（免费提供）重悬细胞，然后沿管壁向离心管小心加入1ml铺板培养基（切勿扰动下层，加入后可见明显分层）；800×g，4℃离心20min（升速为9，降速为1），离心后，吸取纯化培养基和铺板培养基之间的浑浊带（活细胞层），转移到新的15mL离心管中，加入2倍体积的铺板培养基，混匀后，50×g，常温离心5min，去上清，用4ml铺板培养基重悬细胞。

9.      用台盼蓝排除法测定肝细胞的活力和细胞总量，建议检测3次，求取平均值。

10.  按活细胞数1.2~1.8×105cells/cm2的密度接种到胶原包被培养板中，摇匀，在37℃/5%CO2培养箱中培养。推荐步骤：接种后4-6小时，可对细胞轻轻换液（此时细胞处于半贴壁状态），加入预热的新鲜铺板培养基，以提升细胞状态。

V 肝细胞维持培养

1.      培养12-16h，细胞已经完全贴壁，移除铺板培养基（含部分死细胞），加入维持培养基，每2天换液1次。

2.      猪原代肝细胞具有有限的增殖能力，具有明显的接触抑制特性，且肝细胞的分化特性以及培养时间依赖于高密度的细胞培养。

3.      猪原代肝细胞体外维持时间相对较长，建议实验在铺板后8天内完成，最长不超过10天，不建议对猪肝细胞进行传代培养。

VI 关于售后

如您发现有产品任何质量问题，请您收集原始数据，请第一时间联系公司销售或者技术支持，公司安排人员保证售后。每个实验室条件不同，操作人员习惯不同，熟练程度不一样，实验失败存在客观因素。如未严格按照说明书操作、超过售后时限，公司不做售后，请老师理解与支持。

售后有效期与提供的原始数据：

复苏问题：复苏24小时以内；提供台盼蓝染色或者PI染色。

污染问题：复苏96小时以内；提供相差显微镜照片。

纯度问题：一个月内；提供免疫荧光或者流式结果。