概述

pEGFP-N1编码野生型GFP（1-3）的红移变体，该变体已经过优化，可以在哺乳动物细胞中获得更亮的荧光和更高的表达。（最大激发波长＝ 488nm；最大发射波长＝ 507nm。）pEGFP-N1编码GFPmut1变体（4），其包含Phe-64对Leu和Ser-65对Thr的双氨基酸取代。EGFP基因的编码序列包含超过190个沉默碱基的变化，这些变化对应于人类密码子使用偏好（5）。EGFP侧翼的序列已转化为Kozak共有翻译起始位点（6），以进一步提高真核细胞的翻译效率。pEGFP-N1中的MCS在CMV的立即早期启动子（PCMV IE）和EGFP编码序列之间。如果克隆到MCS中的基因与EGFP处于同一阅读框中，并且没有中间的终止密码子，则将被表达为与EGFP N末端的融合体。EGFP基因下游的SV40聚腺苷酸信号指导EGFP mRNA 3'末端的正确处理。载体主链还包含SV40起点，用于在表达SV40 T抗原的哺乳动物细胞中复制。新霉素抗性盒（Neor）由SV40早期启动子，Tn5的新霉素/卡那霉素抗性基因和单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV TK）基因的聚腺苷酸化信号组成，可通过以下方法选择稳定转染的真核细胞：G418。该盒上游的细菌启动子在大肠杆菌中表达卡那霉素抗性。

应用

融合到EGFP的N端保留天然蛋白的荧光特性，允许融合蛋白在体内定位。应该将靶基因克隆到pEGFP-N1中，以使其与EGFP编码序列符合读框，而没有插入框内的终止密码子。插入的基因应包括起始ATG密码子。可以使用任何标准转染方法将重组EGFP载体转染到哺乳动物细胞中。如果需要，可以使用G418（7）选择稳定的转化子。pEGFP-N1也可以简单地用于在目标细胞系中表达EGFP（例如，作为转染标记）。

技术规格