0
一. 配制BSA标准品
注：标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS进行稀释。
BSA标准品配制可参照下表（微孔板检测，线性范围20-2000μg/ml）
管号 | 稀释液体积(μl) | 2mg/ml BSA体积(μl) | BSA终浓度(μg/ml) |
A | 0 | 100 | 2000 |
B | 25 | 75 | 1500 |
C | 50 | 50 | 1000 |
D | 125 | 75 | 750 |
E | 150 | 50 | 500 |
F | 350 | 50 | 250 |
G | 375 | 25 | 125 |
H | 395 | 5 | 25 |
I | 400 | 0 | 0=Blank（空白孔） |
如用试管法检测，每管需加100μl标准品，按3个重复计算，每个浓度至少需配制300μl。
二.配制BCA工作液
A.计算所需要的总BCA工作液体积。
总BCA工作液体积=（标准品+待测样品）×重复数×每个样品所需要的BCA工作液
注意：试管法检测时每个样品加2.0ml BCA工作液，微孔板检测每个样品加200μl BCA工作液。
B.配制BCA工作液：50体积的BCA试剂A中加入1体积的BCA试剂B（A:B=50:1），充分混匀。
注意：BCA试剂B加入BCA试剂A中后，迅速浑浊，通过混匀后立即变澄清。BCA工作液装入密封容器内，室温条件24h稳定。
三.试管法（样品：BCA工作液=1:20）
1.各取100μl标准品和待测样品加入到反应管中。
2.每管加入2.0ml BCA工作液，混匀，37℃孵育30min。
注意：也可室温孵育2h，或者60℃孵育30min。BCA检测蛋白浓度，延长孵育时间会加深颜色反应。升高温度会加快显色反应。但是温度升高和时间延长会降低检测下限，以及降低工作线性范围。
3.冷却到室温。在分光光度计上进行检测，设定波长为562nm。用装满水的比色皿对仪器校零。然后在10分钟内对所有样品读数。
注意：由于BCA反应达不到真正的反应终点，即使温度降低至室温生色反应液会继续。但是，由于室温下生色比率相当低，因此若是10min内能对所有的样本进行562nm吸光度的测试，不会导致明显错误。
4.根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度ug/ml；Y-最终的OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
四.微孔板法（样品：BCA工作液=1:8）
注意：样品与工作液比例为1:8，若样品有限，可使用10μl标准品和待检测样品进行检测（即1:20），这时试剂盒的检测范围为125-2000μg/ml。
2.每孔加入200μl BCA工作液，振荡30s充分混匀。盖上微孔板，37℃孵育30min。
3.冷却到室温，在酶标仪上的540～595nm波长范围处检测吸光度，其中562nm波长为最佳。
注意：延长孵育时间或者提高（样品：BCA工作液比）会增高每个孔的OD562nm净值，并且降低检测下限和工作线性范围。
4.根据BSA标准品的吸光度（减去标准品中空白孔的OD值即最终的读数），绘制标准曲线（X-蛋白浓度ug/ml；Y-最终的OD562nm）。依据标准曲线和样品的稀释倍数计算样品蛋白浓度。
附录：BCA蛋白浓度测定的兼容性
名称 | 耐受浓度 |
Sodium bicarbonate | 100 mM |
Sodium phosphate | 25 mM |
2-Mercaptoethanol | 0.01% |
Glycercol (pure) | 10% |
Glycine-HCl, pH 2.8 | 100 mM |
HEPES | 100 mM |
Hydrochloric acid | 100 mM |
Leupeptin | 10 mg/L |
Nickel chloride (in TBS, pH8.0) | 10 mM |
Nonidet P-40 (NP-40) | 5% (w/v) |
Octyl β -glucoside | 5% (w/v) |
Potassium thiocyanate | 3.0 M |
SDS | 5% |
Sodium acetate, pH 4.8 | 200 mM |
Sodium azide | 0.20% |
Sodium hydroxide | 100 mM |
Sucrose | 40% |
Triton X-100 | 5% |
Triton X-114, X-305,X-405 | 1% |
Tween-20, Tween-60, Tween-80 | 5% |
Zwittergent | 1% |
ACES, pH 7.8 | 25 mM |
Acetone | 10% |
Acetonitrile | 10% |
Ammonium sulfate | 1.5 mM |
Aprotinin | 10 mg/L |
Bicine, pH 8.4 | 20 Mm |
Bis-Tris, pH 6.5 | 33 mM |
Borate, pH 8.5 | 50 mM |
Brij-35 | 5% 温馨提示:因厂家更改产品包装、产地或者更换随机附件等没有任何提前通知，且每位咨询者购买情况、提问时间等不同，为此以下回复仅对提问者3天内有效，其他网友仅供参考！若由此给您带来不便请多多谅解，谢谢！ 服务热线 0771-3293894 |
新浪微博
腾讯微博
QQ空间
客服
