产品简介：

    Caspase 8 活性检测试剂盒(Caspase 8 Activity Assay Kit)是采用分光光度法检测细胞或组织裂
解液中caspase 8酶活性或纯化的caspase 8酶活性的试剂盒。
    Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶
家族。Caspase 8也称FLICE、MACH或Mch5，有时被写作caspase-8或caspase 8，通常以酶原的形式存在，在细胞凋亡的信号转导过程中被激活。Caspase 8被认为是细胞凋亡信号转导过程中比较上游的一个caspase。在Fas-receptor和TNFR-1介导的细胞凋亡过程中caspase 8被激活，形成一个由p18和p10组成的二聚体，进一步激活下游的caspase 4，caspase 6，caspase 9和caspase 10。
    本Caspase 8活性检测试剂盒是基于caspase 8可以催化底物Ac-IETD-pNA(acetyl-Ile-Glu-Thr-Asp
p-nitroanilide)产生黄色的pNA(p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测Caspase 8的活性。pNA在405nm附近有强吸收。
    试剂盒中提供了caspase 8催化产生的黄色产物pNA，可以作为定量caspase 8酶活性的标准品。
    本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测时，除标准曲线外可以检测20个
样品。
包装清单：

保存条件：
    -20℃保存，Ac-IETD-pNA和pNA需避光保存。
注意事项：
    须自备可以测定A405或A400的酶标仪或容量不超过100μl的分光光度检测杯及相应分光光度计。优
先考虑测定A405，如有困难可以测定A400。
    Ac-IETD-pNA需尽量避免反复冻融，请注意适当分装。
    测定蛋白浓度需Bradford蛋白浓度测定试剂盒(P0006)，可向碧云天订购。建议样品用水稀释1倍后
再用Bradford法测定蛋白浓度，以降低DTT对蛋白浓度测定的干扰。
    pNA(中文名为4-硝基苯胺)有毒，请注意小心防护。pNA(10mM)在4℃、冰浴等较低温度情况下会凝固
而粘在离心管管底、管壁或管盖内，可以20-25℃水浴温育片刻至全部融解后使用。
    本试剂盒的裂解液可以和碧云天生产的其它caspase活性检测试剂盒的裂解液通用，即本试剂盒裂解
液制备的蛋白样品可以用于碧云天其它caspase活性检测试剂盒的检测。
    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.准备工作：
  a.裂解液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
  b.检测缓冲液溶解后混匀并置于冰浴上备用。
2.测定pNA标准曲线：
  a.标准品稀释液的配制：按照每0.9ml检测缓冲液加入0.1ml裂解液的比例配制适量的标准品稀释
    液。
  b.把试剂盒提供的pNA (10mM)用标准品稀释液稀释为0、10、20、50、100和200μM，作为标准品。
  c.每个浓度取100μl用酶标仪进行检测，或取适当量用容量不超过100μl的分光光度检测杯进行检
    测，测定A405。
  d.每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405计算出实际的因pNA而导致的吸光度，并制作
    出pNA浓度相对于A405的标准曲线。pNA标准曲线可以参考图1，在0-200μM范围内存在良好的线性
    关系。
                   
    图1.pNA标准曲线。实测数据可能因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参
    考。
3.样品的收集：
  a.对于悬浮细胞：把没有诱导凋亡的对照样品和诱导凋亡的样品，600g 4℃离心5分钟收集细胞，
    小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同前吸尽上清后，按照每200万细
    胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15分钟。下转步骤3d。
  b.对于贴壁细胞：吸取细胞培养液，备用。用胰酶消化贴壁细胞，并收集至备用的细胞培养液中。
    600g 4℃离心5分钟收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次。同
    前吸尽上清后，按照每200万细胞加入100微升裂解液的比例加入裂解液，重悬沉淀，冰浴裂解15
    分钟。下转步骤3d。
  c.对于组织样品：按照每3-10mg组织加入100微升裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃匀浆
    器匀浆。然后把匀浆液转移到1.5ml离心管中，冰浴再裂解5分钟。
  d.4℃ 16,000-20,000g离心10-15分钟。
  e.把上清转移到冰浴预冷的离心管中。
  f.立即测定caspase 8的酶活性或-70℃保存样品。同时可以取少量样品用Bradford法测定蛋白浓
    度，尽量使蛋白浓度达到1-3mg/ml，相当于每10微升待测样品中至少含有10-30μg蛋白。如果细胞
    较小，可以适当增加细胞的用量。
4.Caspase 8酶活性的检测：
  a.取出适量的Ac-IETD-pNA(2mM)，置于冰浴上备用。
  b.如下设置反应体系：