产品简介：

    T4 DNA Ligase即T4 DNA连接酶，可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。同时T4 DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链缺刻(single-strand nicks)。
    用途：T4 DNA Ligase常用于DNA片段和载体、linker或adaptor等的连接。也可以用于缺刻修复及Ligase介导的RNA检测。
    来源：本T4 DNA Ligase由大肠杆菌表达，表达基因的来源为T4嗜菌体。
    活性定义：One unit is defined as the amount of enzyme required to give 50% ligation of HindIII fragments of lambda DNA in 30 min at 16℃ in 20 μl of the assay mixture containing 50 mM Tris, pH 7.5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 μg/ml BSA a 5'-DNA termini concentration of 0.12 μM(300 μg/ml)。200U等于1个Weiss unit，以Weiss unit计，本产品共1000单位。
    纯度：不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶，不含RNA酶，满足常规连接反应要求。
    酶储存溶液：20 mM Tris, pH 7.5, 50 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA 50%(v/v)glycerol。
    10X Ligation Buffer：400 mM Tris, pH 7.8, 100 mM MgCl₂, 100 mM DTT, 5 mM ATP。
    失活或抑制：65℃孵育10分钟可以导致T4 DNA Ligase失活；NaCl或KCl浓度大于200mM时强烈抑制T4 DNA Ligase。
包装清单：

保存条件：
    -20℃保存。
注意事项：
    对于普通的转化大肠杆菌的操作，不必对连接产物进行纯化，连接产物可以直接用于转化。但用电转方法转化大肠杆菌时，通常宜先用DNA纯化试剂盒或酚氯仿抽提方法等纯化DNA，然后再进行电转。
    需进行平端连接或快速连接时，推荐使用碧云天的快速DNA连接试剂盒(D7002/D7003)。T4 DNA Ligase可以进行平端连接，但效率较低。
    普通的连接反应不必进行凝胶电泳观察。如果需要对于连接产物进行凝胶电泳观察，推荐先在65℃孵育10分钟使T4 DNA Ligase失活，以避免T4 DNA Ligase和DNA结合导致的条带位置迁移(band shift)。
    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1. PCR产物或酶切片段和普通载体的连接：
   a. 取1-2μg载体酶切过夜，或至少酶切3-5小时以上。尽量确保酶切充分，否则后续会导致产生很多
      自连的克隆。
   b. 载体酶切完毕后，可以使用试剂盒进行纯化，例如碧云天的PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒
      (D0033)。也可以采用常规的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法纯化载体。对于酶切产生较大片段(大于50-
      60bp)的情况推荐采用切胶回收的方式。
   c. 对于PCR产物：PCR产物凝胶电泳后，切胶回收预期大小的DNA片段。凝胶中DNA片段的回收可以使
      用试剂盒进行操作，例如碧云天的DNA凝胶回收试剂盒(D0056)。也可以采用反复冻融等方法回收
      DNA片段。
   d. 对于回收的PCR产物或其它需酶切的质粒或DNA片段，用适当内切酶酶切，随后纯化酶切产物。
      注：这一步的酶切不必酶切特别充分，通常酶切效率能达到80-90%以上即可。即本步骤的酶切
      通常酶切1-2小时即可。酶切产物可以使用试剂盒进行纯化，例如碧云天的PCR纯化试剂盒/DNA纯
      化试剂盒(D0033)。也可以采用常规的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法纯化载体。
   e. 取约25-100ng经过酶切和纯化的载体，加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体
      系。
      注1：很多时候由于载体量和待插入片段的量都比较少，在回收后很难定量。此时可根据回收前
      电泳条带的亮度进行大致的估计。通常以DNA分子量标准的某一条带为参考，估计或通过灰度半定
      量您的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计
      算出最终得到的载体量和待插入片段量的比例关系。
      注2：通常每个反应使用0.2-0.5μl连接酶已经足够，如果希望进一步提高连接效率，可以把连
      接酶的用量提高至1μl。