产品简介：

    碧云天生产的基因定点突变试剂盒(Site-directed Gene Mutagenesis Kit)可以用于点突变，多个邻近密码子的突变，单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)。
    本试剂盒是一个利用目前最新的基因点突变技术设计而成的试剂盒。只需通过基于PCR的突变质粒的合成，和基于Dpn I的模板质粒的消化，转化培养以及后续的酶切或测序鉴定，即可得到预期的突变质粒(参考图1)。累计操作时间不足2小时即可完成基因的定点突变。
    参考图1，使用本试剂盒时需要先设计长度通常为30个碱基以上的互补的两个引物，在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模板，用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒，但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来源于大肠杆菌等细菌，在细菌中会被甲基化修饰，而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用甲基化酶Dpn I处理，可以消化掉待突变的质粒模板，而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。这样把Dpn I处理过的产物转化细菌后，质粒中有两个nick位点可以被大肠杆菌修复，得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。
    本试剂盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受态细菌的制备。
    本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。
                    
                        图1. 基因定点突变试剂盒原理图
包装清单：

保存条件：
    -20℃保存，一年有效。
注意事项：
    需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。
    需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。需自备用于细菌转化的试剂。
    使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。
    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
 

使用说明：
1. 引物设计：
    用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计：
    (1) 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。
    (2) 引物的长度通常为25-45个碱基。
    (3) 引物中突变位点任何一侧都必需满足4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)≥45。但引物也不宜过长，
        否则通常会形成非常稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，且使两
        侧按照上述计算得到的数值相近。
        例如引物为agtcaggccaattcgaagcagtcgaattgccaag，其中蓝色的aag为突变位点，则
        左侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X7＝46≥45
        右侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X8＝48≥45
    (4) 在可能的情况下，尽量把引物的GC含量控制在40%-60%。
    (5) 在可能的情况下，尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体
        可以通过一些软件进行分析。
    (6) 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。
2. 引物的配制：
    如果合成得到的一个引物A的量是20nmol，另外一个互补引物B的量是19nmol。在引物A中加入200
    微升水，配制成浓度为100μM，在引物B中加入190微升水也配制成浓度为100μM。吸取20微升
    100μM引物A和20微升100μM引物B到一新的离心管中，再加入160微升水，混匀后即可得到可以
    直接用于基因定点突变反应的引物(10μM each)。
3. 待突变模板质粒的选择：
    选择GC含量在40-55%的待突变模板质粒，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果
    GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。另外目的基因
    GC含量最好也在40-55%的范围，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果目的基因
    GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出
    来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的质粒模板，
    或者有局部高GC含量的质粒模板，请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。
    必需使用从dam＋的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变。常
    用的大部分大肠杆菌都是dam＋的，包括DH5α、JM109等。
4. 基因定点突变反应：
    (1) 如下设置基因定点突变反应体系：