产品简介:
碧云天的质粒大量抽提试剂盒(Plasmid Maxi Preparation Kit)是一种用于从大肠杆菌中进行大量质粒的快速抽提的试剂盒。
本试剂盒采用了一种新型的离子交换柱。在特定条件下,使质粒能在离心过柱的瞬间,结合到质粒纯化柱上,在一定条件下又能将质粒充分洗脱,从而实现质粒的快速纯化。无需酚氯仿抽提,无需酒精沉淀,6个样品只需不足90分钟即可完成。
两步过柱纯化,使质粒纯度进一步提高,达到转细胞级要求。
每个质粒纯化柱可以结合的质粒量的上限大于500微克。每个纯化柱可用于抽提100毫升左右用LB培养过夜的大肠杆菌。抽提所得质粒的OD值一般在1.80左右。抽提获得的质粒量会受质粒拷贝数等因素影响。抽提获得的质粒DNA的OD值也会因菌种不同等原因而略有波动。
由本试剂盒所得质粒可直接用于转染细胞,DNA测序,PCR,基于PCR的突变,体外转录,转化细菌,内切酶消化等。本试剂盒抽提的含Firefly luciferase或Renila luciferase报告基因的质粒,用Lipofectmine 2000或Fugene 6转细胞,报告基因检测结果表明仅0.5微克受SV40启动子控制的质粒转化12孔板内的一孔原代贴壁细胞,总RLU值约为五百万,测定时间为10秒。
内毒素(endotoxin)含量低。用对内毒素敏感的细胞转染受内毒素响应的报告基因质粒,与Qiagen昂贵的Endotoxin Free大抽试剂盒相比,检测结果完全一致。
包装清单:
产品编号 |
产品名称 |
包装 |
D0026-1 |
溶液I (悬浮液) |
105ml |
D0026-2 |
溶液II(裂解液) |
105ml |
D0026-3 |
溶液III (结合液) |
150ml |
D0026-4 |
溶液IV (洗涤液) |
84ml×3 (第一次使用前每瓶加入126ml无水乙醇) |
D0026-5 |
溶液V (洗脱液) |
90ml |
D0026-6 |
溶液VI (DNA纯化结合液) |
210ml |
D0026-7 |
RNase A (100mg/ml) |
105μl |
— |
大抽质粒纯化柱 |
20个 |
— |
废液收集管 |
20个 |
— |
说明书 |
1份 |
保存条件:
室温保存,一年有效。
注意事项:
第一次使用前把试剂盒提供的RNase A全部加到溶液I(悬浮液)中,混匀,并在瓶上做好标记。加入RNase A后4℃存放。
第一次使用前在每瓶溶液IV(洗涤液)中加入54ml无水乙醇,混匀,并在瓶上做好标记。
温度较低时,溶液II和溶液III可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀,37℃水浴加热溶解,混匀后使用。溶液II请勿过分剧烈混匀,否则会产生大量气泡。
溶液II使用完后,一定要盖紧瓶盖,防止被空气中二氧化碳酸化。
溶液II有强碱性,溶液II和溶液III对人体都有刺激性,操作时请小心,并注意适当防护。
本试剂盒所有操作均在室温进行,操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
废液收集管在一次抽提中需多次使用,切勿中途丢弃。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明:
1. 取过夜菌至50毫升离心管内,5000g离心1分钟收集细菌沉淀,弃上清。再重复一次,每管总
共收集100毫升过夜菌沉淀。
通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2-4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心
1分钟,如沉淀不充分,则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密,不利于
加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清,再倒入约50毫升菌液并重复上述操作,然后倒置于吸水纸上
(可用普通草纸),使液体流尽。如果细菌密度明显偏低,可考虑使用更多菌 液,再重复上述操作1-
2次。对于高拷贝质粒所用菌量一般不能超过150毫升,对于低拷贝质粒所用菌量一般不能超过200毫
升。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。
2. 每管加入5毫升溶液I,重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开,无可见细菌团块。
确认溶液I中已经添加了RNase A。最高速度vortex10-20秒或更长时间,悬起沉淀。一定要充分混
匀,对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液,无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex,可以用枪吹打
沉淀使沉淀逐渐散开或用手指把沉淀弹开。
3. 每管加入5毫升溶液II,轻轻颠倒离心管4-6次,室温放置3-5分钟,使细菌完全裂解,溶液
透明。
切勿vortex!vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂,易导致最终所得质粒被基因组DNA污
染。颠倒4-6次后,溶液应变得透明,无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开,那么
颠倒4-6次后,可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况,可以增加颠倒次数
3-5次,但总裂解时间不可超过5分钟。
4. 每管加入5毫升溶液III,随即颠倒离心管4-6次混匀,可见白色絮状物产生。
切勿vortex!颠倒次数也不宜过多,否则易导致最终所得质粒的质量下降。
5. 高速(5,000-10,000rpm左右)室温离心10-20分钟。
如果速度较高例如10,000rpm左右,一般离心10分钟已经足够。离心更长时间例如20分钟,会使沉淀
更紧密,更集中于管底,对于进一步提高质粒质量会有所帮助。速度较低时必须适当延长离心时
间,使沉淀更加充分。离心时可以准备好质粒纯化柱,自制漏斗等,并在纯化柱上标上记号。
6. 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。高速离心2分钟,倒弃收集管内液
体。
质粒倒入质粒纯化柱后,可以不用等待,直接离心。倒弃收集管内的液体后,保留收集管继续使
用。本步骤及后续的高速离心2分钟步骤,在离心速度达到10,000rpm时,离心2分钟即足够;在
离心速度为5,000rpm时,则离心时间可以延长到3-4分钟。
7. 在质粒纯化柱内加入7毫升溶液IV,高速离心2分钟,洗去杂质,倒弃收集管内液体。
加入溶液IV后可以不用等待,直接离心。倒弃收集管内的液体后,保留收集管继续使用。
8. 高速离心2分钟,除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。
注意:倒弃收集管内液体后再离心,才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质
量。
9. 将质粒纯化柱置于50毫升离心管上,加入2毫升溶液V至管内柱面上,放置2分钟。
也可以用重蒸水或MiliQ级纯水替代溶液V,但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长,
对于增加质粒产量会略有帮助。
10. 高速离心2分钟,所得液体中加入10毫升溶液VI,混匀后加到原质粒纯化柱内。
加入溶液VI后必须混匀!可颠倒混匀,混匀后切勿离心。
11. 高速离心2分钟,倒弃收集管内液体。
12. 在质粒纯化柱内加入15毫升溶液IV,最高速离心2分钟 ,进一步洗去杂质,倒弃收集管内
液体。
加入溶液IV后可以不用等待,直接离心。倒弃收集管内的液体后,保留收集管继续使用。
13. 高速再离心2分钟,除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。
注意:倒弃收集管内液体后再离心,才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质
量。
14. 将质粒纯化柱置于50毫升离心管上,加入2毫升溶液V至管内柱面上,放置2分钟 。
也可以用重蒸水或MiliQ级纯水替代溶液V,但是水的pH 应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长,
对于增加质粒产量会略有帮助。如想得到较高浓度的质粒,可以加入1.3毫升溶液V洗脱。
15. 高速离心2分钟,所得液体即为转细胞级超纯质粒。
通常所得质粒浓度为0.1-0.3mg/ml。如果想得到高浓度的质粒,可以采用常规的乙醇沉淀的方法浓
缩质粒。
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