使用说明：
1.PCR反应体系的设置：
a.融解并混匀Easy-Load? Plant Direct PCR Master Mix (2X)和Control primer mix (10μM each)，置于冰浴上或冰盒内。
b.参考下表在冰浴上设置PCR反应体系：

注意：
(a)模板使用量：作为PCR模板的植物组织用量，对于20μl和50μl PCR反应体系，植物样品的推荐用量分别为0.1-1mm和0.3-3mm直径叶片或类似大小其它比较柔嫩的植物组织。如果模板为植物种子，尽量使用鲜嫩的植物种子。用干净的解剖刀去掉种子外壳，剪下直径约0.5-2mm的组织直接放入PCR管内；若种子太小，如番茄种子，可直接使用1-2粒完整的种子放入PCR管内进行扩增。50μl PCR体系，植物叶片或是种子直径不宜超过3mm，太多模板易造成PCR抑制成分偏多，影响PCR效果。推荐取两份植物组织样品进行平行的PCR实验，以降低取样的不稳定性。为确保取样的均一性，建议使用专用的打孔器或解剖刀进行取样，并注意防止取样过程中的交叉污染。每一次取样，可以用2%的次氯酸钠溶液清洗打孔器或解剖刀。对于高GC含量的PCR扩增，可以尝试向PCR体系中加入终浓度1-10% (体积百分比)的DMSO。
(b)引物浓度：通常引物的终浓度为0.5μM时可获得良好的检测效果，也可以根据情况在0.1-1.0μM范围内调整引物的终浓度。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度。
c.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体和待检测植物组织积聚于管底。
d.如果所使用的PCR仪有热盖则省略本步骤。如果PCR仪没有热盖，则在管内滴入一滴矿物油(ST275 Mineral oil (矿物油))。
e.把设置好的PCR反应体系置于PCR仪上，开始PCR反应。
2.PCR反应参数的设置可以参考如下表格：

注意：
a.起始变性(94℃，5min)可以使植物组织样品裂解，释放出可用于PCR扩增的基因组DNA。
b.需根据每次反应的模板、引物、PCR产物的长度和GC含量等适当优化PCR反应条件，包括温度、时间和循环数等。
c.对于初次进行的PCR，为尽量确保可以扩增出预期的PCR产物，可以把循环数设置为35。

常见问题：
1.PCR产物非常少或没有特异性条带。
a.引物设计不佳是PCR过程中最常见的问题。请选择适当的引物设计软件进行引物设计，注意引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在加入酶切位点等的引物中，一定要注意加入酶切位点等后整条引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。在原有引物效果不佳的情况并且阳性对照引物可以正常工作的情况下，可以考虑更换引物。
b.待扩增片段GC含量偏高。向PCR体系中尝试加入适合扩增高GC含量DNA片段的试剂。
c.目的片段过长。尽管PlantTaq? DNA Polymerase可以扩增最长达5kb的DNA片段，但大多数时候更适合扩增2-3kb以下的片段。对于过长的目的片段的扩增，需要适当优化引物和PCR反应参数。
d.引物的二级结构、引物二聚体或引物偏短会导致退火效果不佳。此时可以采用Touch down等方法进行退火，通常采用从65℃逐步缓慢降温到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
e.退火温度不佳，需要优化。如果有温度梯度PCR仪，则可以设置退火的温度梯度，摸索退火的最佳温度。如果没有温度梯度PCR仪，则可以通过多次PCR反应摸索最佳的退火温度。
f.延伸时间不足。可按照每1kb片段延伸2分钟进行设置，对于较难扩增的片段可以设置为每1kb片段延伸3-4分钟。
g.在不同PCR仪上进行PCR反应，避免有时PCR仪出现问题。
h.循环数不足，适当延长PCR的循环数。通常循环数最高不必超过40，常用的循环数范围为30-40。
i.模板用量偏少，可以在耐血体积范围内适当加大样品用量，或采用巢式PCR (nested PCR)或二次PCR。巢式PCR即为在原先设计的PCR引物内侧再设计一对PCR引物，然后对第一次PCR产物进行稀释后再进行一次PCR扩增，这样一方面可以起到扩增作用，同时也可以从第一次PCR产物中扩增出特异性条带。二次PCR则为比较简单地用原有引物对第一次PCR产物进行稀释后再进行一次PCR扩增，可以起到扩增作用，但不能去除非特异性条带。
j.对PCR引物进行脱盐甚至PAGE胶或HPLC纯化。
k.当产生较多非特异性条带时，可以适当提高退火温度。
l.注意设置适当的阳性对照和阴性对照通常会对于实验结果的判断有很大帮助。
2.杂带较多或条带弥散
a.退火温度提高2-5℃。
b.减少植物组织样品的用量。
c.在室温配制PCR体系容易产生非特异性条带。推荐在冰浴上配制PCR反应体系。
d.如果模板的GC含量过高，需要考虑加入适合扩增高GC含量DNA片段的试剂。
e.适当缩短延伸时间。

相关产品：