烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP) 是磷酸戊糖途径 (一种细胞代谢途径) 反应中一种重要的辅因子。 NADP以氧化态NADP+和还原态NADPH的形式存在于细胞中。NADPH不光对脂肪酸、胆固醇而且对还原 型谷胱甘肽的生成至关重要。另外最近的研究表明，NADP+/NADPH通过限制碳水化合物的摄入来延长寿命与NADP+/NADPH有很大关联1)。 NADP/NADPH Assay Kit-WST能定量检测细胞中总NADP+/NADPH、NADPH和NADP+的量，并计算它们的比值。细胞内NADPH水平可以用试剂盒内的Extraction Buffer裂解细胞后加热进行定量检测。而细 胞内的NADP+水平则可以通过总NADP+/NADPH减去NADPH的量计算得到。
图1.用NADP/NADPH Assay Kit-WST检测NADP的原理
图2.总NADP+/NADPH、NADPH和NADP+的检测方法
注意事项：
使用前请将试剂盒恢复至室温后使用。
因为内容物可能粘附在管壁或管盖上，在开盖前请离心管子（Dye Mixture和Standard）。
由于酶会悬浮在液体上层，在使用前请先吹打混匀以获得均质的液体。
推荐每个样品做3个复孔以获得准确的数据。
由于在Working Solution加入孔中后酶会立刻反应，请使用多通道移液器以减少由于加样时间延迟而导致的实验误差。
请准备不同稀释比例的样品，并确定一个合适的稀释比例以使浓度范围在0-1 μmol/l。
溶液配制：
配制Dye Mixture储存液
在Dye Mixture管中加入550 μl超纯水并充分溶解。
※因为内容物可能粘附在管壁或管盖上，在开盖前请先离心管子。
※Dye Mixture储存液在-20°C避光可以保存2个月。
配制Standard储存液（10 mmol/l）
在Standard管中加入20 μl 超纯水，并吹打溶解。
※因为内容物可能粘附在管壁或管盖上，在开盖前请先离心管子。
※Standard储存液要在冰浴中实验。
※Standard储存液在-20°C可以保存2个月。
配制Working Solution
（1） 将Dye Mixture储存液加入圆锥管中，并用Assay Buffer稀释。
（2） 将Enzyme加入到步骤（1）配制的溶液中。
参考表1
| | 48孔板 | 96孔板 |
| Dye Mixture 储存液 | 270 μl | 540 μl |
| Assay Buffer | 2.43 ml | 4.86 ml |
| Enzyme | 54 μl | 108 μl |
表1.Working Solution配制例
※Working Solution对光敏感，请在使用前配制，并用铝箔包裹避光，请在当天内用完。
操作步骤：
1、 样品制备
（1） 在1.5 ml微量管中制备细胞悬液（5-40×105 个细胞）。
（2） 在300×g离心5 min，去除上清液。
（3） 在每管中加入500 μl PBS，吹打悬液，在300×g离心5 min，去除上清液。
（4） 在每管中加入300 μl NADP/NADPH Extraction Buffer，吹打裂解细胞，在12,000×g离心5 min。
（5） 将250 μl上清液转移到MWCO 10K超滤管中，并在12,000×g离心10 min。
※测定总NADP+/NADPH和NADPH各至少需要100 μl样品（总样品量：200 μl）。
（6） 参照图3分别在2个1.5 ml微量管中加入100 μl滤液，并将其分别作为总NADP+/NADPH和NADPH的样品。
（7） 将NADPH的样品溶液在60°C培养60 min。
※此步是为了分解样品溶液中的NADP+。
※在检测前，将用于检测总NADP+/NADPH的样品溶液放在冰浴中。
（8） 培养后，将步骤7中的样品溶液冷却至室温。
（9） 分别在步骤6的总NADP+/NADPH样品管中和步骤8的NADPH的样品管中加入100 μl NADP/NADPH Control Buffer，用这些溶液进行检测。
※检测时每孔需要50 μl样品。
※请准备不同稀释比例的样品，并确定一个合适的稀释比例以使浓度范围在0-1 μmol/l。用NADP/NADPH Control Buffer稀释样品。
图3.分别检测总NADP+/NADPH和NADPH的示意图
2、配制标准液
（1） 用198 μl 超纯水稀释2 μl 10 mmol/l的Standard储存液，配制成100 μmol/l的标准液。
将5 μl 100 μmol/l 标准液和495 μl Standard Buffer在离心管中混合，配制成1 μmol/l的标准液。用Standard Buffer如下图稀释配制成系列浓度（浓度分别为1 μmol/l,0.5 μmol/l,0.25 μmol/l,0.125 μmol/l,0.0625 μmol/l,0.0313 μmol/l,0.0157 μmol/l和0 μmol/l）的标准液。
图4. 配制标准液
3、检测
（1）按照图5，在每孔中分别加入50 μl的标准液和样品溶液。
※为了获得准确的数据，建议每个样品做3个复孔。
图5.96孔板排列示例（n=3）
（2）在每孔中加入50 μl Working Solution。
※由于在加入Working Solution后酶会立刻反应，请用多通道移液器以减少由于加液时间延迟而导致的实验误差。
（1） 在37°C培养60 min。
※培养时请密封培养板，以防止液体蒸发。
（2） 用酶标仪在450 nm处检测吸光度。
（3） 用标准曲线测定样品中总NADP+/NADPH和NADPH的量。
※如果原样品在检测前已稀释，可用稀释倍率乘以检测的数值。
※NADP+的量可用下列计算公式计算：总NADP+/NADPH-NADPH的量计算得到。
NADP+=总NADP+/NADPH-NADPH
.jpg)
.jpg)
新浪微博
腾讯微博
QQ空间
客服
