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本产品是采用 SYBR Green I 嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂，将热启动Taq DNA聚合酶、dNTP、SYBR Green I等试剂预混成即用的2x Mix，可对目标cDNA进行快速并具有高特异性的定量检测。本产品采用化学修饰的Hot Start Taq DNA聚合酶，在 50 ℃以下无活性，只有 95 ℃条件下加热后才能完全恢复酶的活力，最大限度减少非特异性扩增产物的产生，提高荧光定量PCR反应的精确性。该试剂盒独特的反应缓冲液，可在宽范围中得到良好的扩增结果、检测灵敏度更高、信号更强。
产品组分：
产品编号 | 产品名称 | 规格 |
1 | 2×SYBR Green qPCR Mix | 5 x 1ml |
2 | 50×ROX Reference Dye | 1ml |
保存条件：
收到本产品后，请立即置于-20℃避光保存，一年有效，2～8℃条件下储存6个月，避免反复多次冻融。
使用说明：
一、配制 Real-Time PCR反应体系：
1、将所有试剂2×SYBR Green qPCR Mix，ROX Reference Dye，模板，引物和RNase-Free ddH2O，在室温下融解并彻底混匀，避免产生气泡。短暂离心后，置于冰上按照下表配制反应液。
参考下表配制反应体系：
组分 | 20ul体系 | 50ul体系 | 终浓度 |
SYBR Green qPCR Mix | 10μl | 25 μl | 1× |
Primer F (10 μM)* | 0.4~0.8 μl | 1.5 μl | 0.2~0.4 uM* |
Primer R (10 μM)* | 0.4~0.8 μl | 1.5 μl | 0.2~0.4 uM* |
50 x ROX Reference Dye** | － | － | － |
cDNA模板 | － | － | -- |
RNase-Free ddH2O | 至20 μl | 至50 μl | － |
* 一般来说反应体系中引物终浓度为0.2 uM即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在终浓度0.2~0.4 uM范围内调整引物浓度。
** 几种常见仪器的最适ROX Reference Dye浓度见下表：
仪器型号 | 使用浓度 |
ABI PRISM 7000/7300/7700/7900HT/StepOne/ StepOne Plus等 | 5×（20ul体系加2ul，50ul体系加5ul） |
ABI 7500/7500 Fast、QuantStudio ? 3/5、QuantStudio 6/7 Flex、ViiA 7、Stratagene Mx3000P/Mx3005P和Mx4000等 | 1×（20ul体系加0.4ul，50ul体系加1ul） |
Roche、Bio-Rad、Eppendorf等 | 无需添加 |
2、盖上或密封反应管/PCR板，轻轻混匀。短暂离心，确保所有组分都在管/板底。
二、进行Real-Time PCR反应
1、建议采用两步法PCR反应程序进行反应。
两步法反应程序:
步骤 | 温度 | 持续时间 | 循环数 |
预变性 | 95℃ | 5min | 1 |
变性 | 95℃ | 10sec | 40 |
退火延伸数据采集 | 60℃ | 30sec | 40 |
熔解曲线分析 | 根据仪器推荐程序设置 | ||
若模板量较低等因素导致扩增效果不佳，可使用三步法程序进行PCR反应。
三步法反应程序:
步骤 | 温度 | 持续时间 | 循环数 |
预变性 | 95℃ | 5min | 1 |
变性 | 95℃ | 10sec | 40 |
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