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Phospho-c-Jun (Ser73) (D47G9) XP® Rabbit mAb 20µl

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品牌：CST

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产品使用信息

为了获得最佳的 ChIP 和 ChIP-seq 结果，每次免疫沉淀使用 10 μl 抗体和 10 μg 染色质（大约 4 x 106 个细胞）。该抗体已使用 SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kits 进行了验证。

应用 稀释度
蛋白质印迹法 1:1000
免疫沉淀 1:50
免疫组织化学（石蜡） 1:200
免疫荧光法（冰冻） 1:800
免疫荧光法（免疫细胞化学） 1:800
流式细胞术 1:200
染色质免疫沉淀法 1:50
ChIP-seq 1:50

保存

保存在 10 mM sodium HEPES (pH 7.5)、150 mM NaCl、100 µg/ml BSA、50% 甘油和低于 0.02% 的叠氮化钠中。存储温度为 -20℃。请不要分装抗体。

实验步骤

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蛋白质印迹法实验步骤

要进行蛋白质印迹法分析，在 4°C 下，将膜与稀释的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween® 20 中一起孵育，轻晃孵育一整夜。

注意：请参阅一抗说明书或产品网页了解建议使用的抗体稀释度。

A. 溶液和试剂

从样品制备至检测，蛋白质印迹法需要用到的试剂在一个套装试剂盒中提供：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 并混合。
  2. 10 X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 要制备 1 L 1X TBS：加入 100 ml 10X 至 900 ml dH2O 并混合。
  3. 1X SDS 上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，以制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 将其稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：添加 100 ml 10X 电泳缓冲液至 900 ml dH2O 中并混合。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
  6. 含有 Tween® 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
  9. 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
  10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制备 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混匀。
  12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
  13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa)：(#13953)。
  14. 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 µm 孔径。
  15. HRP 偶联二抗：Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody (#7074)。
  16. 检测试剂：SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

  1. 添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 从培养物中吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞；吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA（以降低样品粘度）。
  5. 取 20 µl 样品，在 95–100°C 下加热 5 分钟；放在冰上冷却。
  6. 微量离心机内离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 到 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm) 上。

    注意：建议将预染蛋白分子量标准品（#13953，5 µl/泳道）上样，以验证转膜的效率，生物素化蛋白质标准品（#7727，10 µl/泳道）可以直接在膜上显出条带以确定分子量。

  8. 电转至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，可相应调整体积。

I. 膜封闭

  1. （可选）转移之后，在室温下用 25 ml TBS 将硝酸纤维素膜洗涤 5 分钟。
  2. 将膜置于 25 ml 封闭缓冲液中，在室温下孵育 1 小时。
  3. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。

II. 一抗孵育

  1. 将膜和一抗（按照产品说明书中建议的适当稀释度和稀释液）置于 10 ml 一抗稀释缓冲液中在 4°C 下孵育过夜并不时轻轻晃动。
  2. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  3. 使用 10 ml 封闭缓冲液稀释 Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody （#7074，按 1:2000 的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody （#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）用以检测生物素化蛋白标准品。将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育 1 小时。
  4. 用 15ml TBST 洗涤三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

D. 蛋白质检测

使用说明：

  1. 在 TBST 中清洗与膜结合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持续 5 分钟。
  2. 通过稀释一部分 2X 试剂 A 和一部分 2X 试剂 B（例如：要制备 10 ml，则添加 5 ml 试剂 A 和 5 ml 试剂 B），来制备 1X SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。混匀。
  3. 将底物与膜一起孵育 1 分钟，倒掉多余溶液（膜将保持湿润），然后包裹在塑料中并在 X 线胶片下曝光。

* 避免反复接触皮肤。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2013 年 11 月

蛋白质印迹法再标记实验步骤

在样品数量有限时，在现有的膜上反复单独检测多种蛋白进行免疫印迹分析来说是一种非常方便的方法。应注意的是，为了获得最好的结果，始终建议您进行新的印记实验以进行分析。重新检测是一种比较有效的方法，但在每一次重新检测印迹时，背景信号可能会增强。此外，建议您在进行重新检测前确认一抗复合体已被清除，以便与新抗体结合而产生的信号不是第一次免疫印迹实验的残余信号。这可通过再次将印迹暴露于 ECL 试剂并确保在添加下一个一抗前无信号来确认。

A. 溶液和试剂

注意：用反渗透去离子 (RODI) 水或等效净化水制备溶液。

  1. 洗涤缓冲液：Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST-10X) (#9997)
  2. 洗脱缓冲液：要制备 100 ml，可将 1M Tris-HCl pH 6.8 的 6.25 ml、20% SDS 的 10 ml 和 700 μl β-巯基乙醇混合。使用去离子化 H20 补足至 100 ml。仅在使用前制备新鲜的缓冲液。

B. 实验步骤

  1. 胶片下曝光后，将膜置于 TBST 中清洗四次，每次 5 分钟。在膜未干燥的情况下才可获得最佳结果。
  2. 在 50°C 下，在膜再生液中将膜孵育 30 分钟，同时轻轻晃动。
  3. 在 TBST 中将膜清洗六次，每次 5 分钟。
  4. （可选）为了确保已清除原始信号，用 5 ml TBST 将膜清洗两次，每次 10 分钟。将膜与 LumiGLO® 在室温下孵育 1 分钟，同时轻轻搅动。将膜上多余的显影液沥干。切勿令膜干燥。包在塑料包裹膜中并曝光于 X 射线胶片。
  5. 再次在 TBST 中将膜清洗四次，每次 5 分钟。
  6. 膜现在可以再次使用了。根据免疫印迹分析实验步骤中的“膜封闭和抗体孵育”步骤开始检测。

发布​于 2005 年 6 月 

修订于 2016 年 10 月

实验步骤编号：10

天然蛋白质免疫沉淀法

本实验步骤适用于使用蛋白 A 磁珠分离法对天然蛋白进行免疫沉淀，以进行蛋白质免疫印迹或激酶活性分析。

A. 溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS，将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O 中并混合。

  2. 10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 的 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液添加至 9 ml dH2O，并混合。

    注意：使用前，请立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

  3. 3X SDS上样缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。
  4. Protein A Magnetic Beads：(#73778)。
  5. 磁分离架：(#7017) 或 (#14654)。
  6. 10X 激酶缓冲液（用于激酶试验）：(#9802) 要制备 1 ml 的 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加至 900 µl dH2O 中并混合。
  7. ATP (10 mM)（用于激酶试验）：(#9804) 要制备 0.5 ml 的 ATP (200 µM)，将10 µl ATP (10 mM) 添加至 490 µl 1X 激酶缓冲液中。

B. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，使其对细胞进行处理一段时间。
  2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。
  3. 去除 PBS，每块平板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液，平板放在冰上孵育 5 分钟。
  4. 从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  5. 在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。
  6. 在 4°C，在 14,000 x g 条件下，微量离心 10 分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清（可选）

强烈建议进行细胞裂解物预清除步骤，以减少结合 Protein A Magnetic beads 的非特异性蛋白。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。

  1. 稍微涡旋母液试管，以重悬磁珠。

    重要提示：使用前，预先洗涤 #73778 磁珠：

  2. 转移 20 μl 珠浆到一根干净的试管中。将试管放在磁分离架上 10-15 秒钟。

    一旦溶液变澄清，便小心清除缓冲液。添加 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液到磁珠沉淀物中，稍微涡旋以洗涤珠子。将试管放回磁分离架。一旦溶液变澄清，便清除缓冲液。再次进行洗涤步骤。

  3. 添加 200 μl 细胞裂解物到 20 μl 预先洗涤的磁珠中。

    重要提示：最佳裂解物浓度将取决于目的蛋白的表达水平。建议起始浓度为 250 μg/ml-1.0 mg/ml。

  4. 在室温下旋转孵育 20 分钟。
  5. 使用一个磁分离架将珠子与裂解物分离，并将预澄清的裂解物转移到一根干净的试管中，随后去除磁珠沉淀物。
  6. 继续进行免疫沉淀部分。

免疫沉淀

重要提示：强烈建议使用相应的同型对照，以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。使用 Normal Rabbit IgG #2729、Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control #3900 和 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 分别进行兔多克隆一抗、兔单克隆一抗和小鼠单克隆一抗的对照检测。同型对照的浓度应匹配，并与一抗样品同时进行。

  1. 将一抗（按产品数据表中建议的合适稀释比例）添加到 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜，从而形成免疫复合物。
  2. 预先洗涤磁珠（参见细胞裂解物预澄清部分，步骤 1 和 2）。
  3. 将裂解物和抗体（免疫复合物）溶液转移到一根含有已洗涤磁珠沉淀物的试管中。
  4. 室温下振摇孵育 20 分钟。
  5. 使用磁性分离架将磁珠沉淀小球。用 500 µl 的 1X 细胞裂解缓冲液，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
  6. 继续使用免疫印迹法或激酶活动进行分析（D 部分）。

D. 样品分析

继续下述其中一项的具体步骤。

用蛋白免疫印迹法进行分析

  1. 在 20-40 µl 3X SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍微微量离心分离来让样品沉淀。
  2. 将样品加热到 95–100°C，并持续 5 分钟。
  3. 使用磁性分离架将磁珠沉淀小球。将上清液转移到新试管。上清液为样品。
  4. 用蛋白质印迹法分析样品（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

注意：为了最大限度减少变性 IgG 重链 (~50 kDa) 产生的遮盖作用，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP 缀合物 #5127）。为了最大限度减少变性 IgG 轻链产生的遮盖作用 (~25 kDa)，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）

用激酶活性测定法进行分析

  1. 用 500 µl 1X 激酶缓冲液洗涤沉淀物两次。置于冰上。
  2. 在 40 µl 1X 激酶缓冲液中悬浮沉淀物，并补充 200 µM ATP 和适当的底物。
  3. 30°C 条件下孵育 30 分钟。
  4. 用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。
  5. 将含有磷酸化底物的上清转移到另一管中。
  6. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟，然后在 14,000 x g 下瞬时离心 1 分钟。
  7. 将样品 (15-30 µl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。

发布​于 2008 年 12 月 

修订于 2018 年 4 月

实验步骤编号：410

免疫组织化学（石蜡）

A. 溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 二甲苯。
  2. 无水变性乙醇，组织级（100% 和 95%）。
  3. 去离子水 (dH2O)。
  4. 苏木精（可选）。
  5. 洗涤缓冲液：
    1. 含 Tween® 20 (TBST) 的 1X Tris 盐缓冲液：要制备 1L 1X TBST，添加 100 ml 含 Tween® 20 的 10 X Tris 盐缓冲液 (#9997) 至 900 ml dH20 中并混合。
  6. SignalStain® Antibody Diluent (#8112).
  7. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 的 1X 柠檬酸盐修复液，将 25 ml 的 SignalStain® Citrate Unmasking Solution (10X) (#14746) 稀释到 225 mL 的 dH2O 中。
  8. 3% 过氧化氢：要制备 100 ml，添加 10 ml 30% H2O2 至 90 ml dH2O 中。
  9. 封闭液：TBST/5% Normal Goat Serum 或 1X Animal-Free Blocking Solution。
    1. TBST/5% Normal Goat Serum：要制备 5 ml 1X TBST，添加 250 µl Normal Goat Serum (#5425)。
    2. 1X Animal-Free Blocking Solution：要制备 4 mL of dH2O，添加 1 ml 的 Animal-Free Blocking Solution (5X) (#15019)。
  10. 检测系统：SignalStain® Boost IHC Detection Reagents (HRP, Rabbit #8114)。
  11. 底物：Vector® NovaRED™ (Vector Laboratories)。
  12. 苏木精： Hematoxylin (#14166)。
  13. 封片剂： SignalStain® Mounting Medium (#14177)。

B. 脱蜡/复水

注意：在制作过程中务必随时保持切片处于湿润状态。

  1. 脱蜡/水化合步骤：
    1. 将切片放入二甲苯的洗液中孵育 3 次，每次 5 分钟。
    2. 将切片放入 100% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
    3. 将切片放入 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。
  2. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。

C. 抗原修复

对于柠檬酸盐：将切片浸入 1 X 柠檬酸盐修复液，再放入微波炉中加热直至沸腾；继续保持亚沸腾温度 10 分钟 (95°-98°C)。在实验台上冷却切片 30 分钟。

D. 染色

  1. 用 dH2O 清洗切片三次，每次 5 分钟。
  2. 切片放入 3 % 过氧化氢水溶液中，孵育 10 分钟。
  3. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
  4. 用洗涤缓冲液清洗切片持续 5 分钟。
  5. 使用 100–400 µl 封闭液将每张切片在室温下封闭 1 小时。
  6. 去除封闭液，并给每块切片添加 100–400 µl 在 SignalStain® Antibody Diluent (#8112) 中稀释过的一抗。4°C 孵育过夜。
  7. 使 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114) 平衡至室温。
  8. 清除抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
  9. 根据需要在切片上滴 1–3 滴 SignalStain® Boost Detection Reagent (HRP, Rabbit #8114)。在加湿箱中室温孵育 30 分钟。
  10. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次，每次 5 分钟。
  11. 根据制造商建议说明制备 Vector® NovaRED™。
  12. 在每张切片上应用 100–400 µl 底物并密切观察，通常 1-10 分钟即可得到合适的染色强度。
  13. 将切片浸入 dH2O 中。
  14. 如果需要，使用 hematoxylin (#14166) 复染切片。
  15. 用 dH2O 清洗切片两次，每次 5 分钟。
  16. 使切片脱水：
    1. 在 95% 乙醇中孵育切片 2 次，每次 10 秒。
    2. 在 100% 乙醇中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
    3. 在二甲苯中重复孵育 2 次，每次 10 秒。
  17. 使用盖玻片和封片剂 (#14177) 封片。

检测试剂/底物兼容性
推荐的
检测试剂		 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114 SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (AP, Rabbit) #18653
兼容的
色原		 SignalStain® DAB Substrate Kit #8059 SignalStain® Vibrant Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit #76713
SignalStain® Vivid Purple Peroxidase Substrate Kit #96632  

注意：使用本实验步骤中未指定的检测试剂可能需要进一步优化一抗，考虑到检测试剂的不同灵敏度。


发布​于 2010 年 2 月 

修订于 2020 年 4 月

实验步骤编号：300

免疫荧光法（冰冻）

A. 溶液和试剂

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭缓冲液：（1X PBS / 5% 常规血清/ 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如 Normal Goat Serum (#5425) 添加至 9.5 ml 1X PBS）并充分混合。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液： (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton™ X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (#9998)，并混合。

  5. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗：

    注意：首次使用一抗或荧光物质标记的二抗时，用滴定法检测抗体，以确定哪种稀释度会在最低的背景下为您的样品产生最强的特定信号。

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 样品制备 - 冰冻/恒冷箱切片 (IF-F)

  1. 冰冻固定组织进行免疫染色（C 部分）。
  2. 对新鲜未固定的冰冻组织，请立刻按下列步骤固定：

    1. 切片用 1X PBS 中稀释的 4% 甲醛浸没。

      注意：甲醛有毒性，仅可在通风橱中使用。

    2. 室温下固定切片 15 分钟。
    3. 吸干液体后用 1X PBS 冲洗三次，每次 5 分钟。
    4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭标本时，按照说明书中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
  9. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2016 年 7 月

实验步骤编号：151

免疫荧光法（免疫细胞化学）

A. 溶液和试剂

若想获得高质量的免疫荧光图片，请使用我们 #12727 Immunofluorescence Application Solutions Kit 中高效且划算的预制试剂。

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 20 X 磷酸盐缓冲液 (PBS)： (9808) 要制备 1L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O 中并混合。调节 pH 至 8.0。
  2. 甲醛：16%，无甲醇，Polysciences 公司生产。（cat# 18814），使用新鲜制剂，小瓶打开后在 4°C 避光保存，同时在 1X PBS 中稀释使用。
  3. 封闭缓冲液（1X PBS / 5% 正常血清 / 0.3% Triton™ X-100）：要制备 10 ml，添加 0.5 ml 与二抗同一物种来源的正常血清（例如 Normal Goat Serum (#5425)）和 0.5 mL 20X PBS 至 9.0 mL dH2O 中并充分混匀。搅拌时加入 30 µl Triton™ X-100。
  4. 抗体稀释缓冲液 (1X PBS / 1% BSA / 0.3% Triton X-100)：要制备 10 ml，添加 30 µl Triton™ X-100 至 10 ml 1X PBS 中。充分混合后，添加 0.1 g BSA (9998)，并混合。

  5. 建议使用偶联荧光素的抗兔二抗：

  6. Prolong® Gold AntiFade Reagent (#9071)，Prolong® Gold AntiFade Reagent with DAPI (#8961)。

B. 标本制备 - 培养细胞系 (IF-IC)

注意：细胞应当在多孔板、腔室玻片或盖玻片上直接培养、处理、固定和染色。

  1. 吸干液体，随后在细胞上覆盖一层 2–3 mm 用 1X PBS 稀释的 4% 甲醛。

    注意：甲醛有毒性，需在通风橱中使用。

  2. 室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 吸干固定液，用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  4. 继续进行免疫染色操作（C 部分）。

C. 免疫染色

注意：所有随后的孵育都应当在室温下完成，除非另有注明需要在避光湿盒或带盖的培养皿/板中孵育，以防止干燥和荧光物质淬灭。

  1. 在封闭缓冲液中封闭标本 60 分钟。
  2. 封闭标本时，按照说明书中推荐的稀释比例，在抗体稀释缓冲液中配制一抗。
  3. 吸去封闭缓冲液，加入稀释后的一抗。
  4. 4°C 孵育过夜。
  5. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  6. 用抗体稀释缓冲液将荧光物质标记的二抗稀释后，室温下避光孵育标本 1–2 小时。
  7. 用 1X PBS 漂洗三次，每次 5 分钟。
  8. 使用 Prolong® Gold Antifade Reagent (#9071) 或 Prolong® Gold Antifade Reagent with DAPI (#8961) ，用盖玻片盖住切片。
  9. 要达到最佳效果，使用封片液室温过夜。将切片平放避光 4°C 环境下，可长期保存。

发布​于 2006 年 11 月 

修订于 2013 年 11 月

实验步骤编号：24

针对兔抗体的甲醇通透实验步骤（流式细胞术）

A. 溶液和试剂

本实验步骤中所需的所有试剂可与我们的 Intracellular Flow Cytometry Kit (Methanol) #13593 一起高效购买，或使用下文所列的货号单独购买。

注意：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

  1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：要制备 1 L 1X PBS：添加 100 ml 10X PBS (#12528) 到 900 ml 水中混合。
  2. 4% 甲醛，不含甲醇 (#47746)
  3. 100% 甲醇 (#13604)：用前冷却
  4. 抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液 (#13616)，或在 100 ml 1x PBS 中溶解 0.5 g 牛血清白蛋白 (BSA) (#9998) 来制备 0.5 % BSA PBS 缓冲液。储存在 4°C。
  5. 建议使用抗兔二抗：
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 488 Conjugate) #4412
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 594 Conjugate) #8889
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (Alexa Fluor® 647 Conjugate) #4414
    • Anti-Rabbit IgG (H+L), F(ab')2 Fragment (PE Conjugate) #79408

注意：在您的实验中加入荧光细胞染料（包括活性染料、DNA 染料等）时，请参考染料产品页，了解建议的实验步骤。访问 www.cellsignal.com/flowdyes，了解经流式细胞术验证的细胞染料列表。

B. 固定

注：固定前，应分离黏附细胞或组织，并放在单细胞悬浮液中。

注意：理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。一般，1-5 分钟 150-300g 将足以使细胞沉淀。

注意：如果使用全血，则需在固定前裂解红细胞并通过离心洗涤。

注意：如果表位被甲醛和/或甲醇破坏，可以在固定前添加靶向 CD 标记物或其他胞外蛋白的抗体。在固定和透化过程中，这类抗体保持结合目的靶标。但注意，某些荧光团（包括 PE 和 APC）会被甲醇损坏，因此不应在透化前添加。如果您不确定，请进行小规模实验。

  1. 进行离心使细胞沉淀，并去除上清液。
  2. 按每 100 万个细胞大约 100 µl 4% 甲醛的密度重悬细胞。混匀以解离沉淀物，并阻止个别细胞出现交联。
  3. 在室温 (20-25°C) 下固定 15 分钟。
  4. 用足够的 1X PBS 离心洗涤。将上清液丢弃在合适的废液缸中。在 0.5-1 ml 1 X PBS 中重悬细胞。继续进行通透步骤。
    1. 或者，细胞可放在 1X PBS 中保存在 4°C 下过夜。

C. 通透

  1. 通过温和涡旋混合情况下向预冷的细胞中缓慢添加冰冷的 100% 甲醇至 90​% 甲醇的终浓度，以通透细胞。
  2. 在冰上通透至少 10 分钟。
  3. 继续进行细胞免疫染色（D 部分）或将细胞储存于 -20°C 的 90% 甲醇中。

D. 免疫染色

注：使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。

  1. 将所需数量的细胞分装进试管或加样孔中。（通常，每次实验 5 x 105 至 1 x 106 个细胞。）
  2. 通过离心分离，用足够的 1X PBS 洗涤以清除甲醇。将上清液丢弃在合适的废液缸中。如有必要，可重复进行。
  3. 在 100 µl 稀释的一抗中重悬细胞，稀释的一抗按建议的稀释度或根据滴定确定用抗体稀释缓冲液制备。
  4. 室温孵育 1 小时。
  5. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  6. 在 100 µl 稀释的荧光物质偶联的二抗（按建议稀释度用抗体稀释缓冲液制备）中重悬细胞。
  7. 室温孵育 30 分钟。避光保存。
  8. 用抗体稀释缓冲液或 1X PBS 进行离心洗涤。丢弃上清液。重复操作。
  9. 在 200-500 µl 1X PBS 中重悬细胞，并在流式细胞分析仪上进行分析。

发布​于 2009 年 7 月 

修订于 2019 年 8 月

实验步骤编号：404

染色质免疫沉淀法

特定产品: SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005。

所需的试剂

包括的试剂：

  1. Glycine Solution (10X) #7005
  2. Buffer A (4X) #7006
  3. Buffer B (4X) #7007
  4. ChIP Buffer (10X) #7008
  5. ChIP Elution Buffer (2X) #7009
  6. 5 M NaCl #7010
  7. 0.5 M EDTA #7011
  8. ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006
  9. DNA Binding Buffer #10007
  10. DNA Wash Buffer（使用前添加 4x 体积乙醇）#10008
  11. DNA Elution Buffer #10009
  12. DNA Purification Columns and Collection Tubes #10010
  13. Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012
  14. RNAse A (10 mg/ml) #7013
  15. Micrococcal Nuclease #10011
  16. Proteinase K (20 mg/ml) #10012
  17. SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014
  18. SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015
  19. Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620
  20. Normal Rabbit IgG #2729
  21. DTT (Dithiothreitol) #7016

未包括的试剂：

  1. Magnetic Separation Rack #7017 / 14654
  2. Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872
  3. Nuclease-free Water #12931
  4. 乙醇 (96-100%)
  5. 甲醛（37% 母液）
  6. SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989
! 这就表示在实验流程中基于免疫沉淀制备物（IP 制备物）数量的容积改变是重要的一步。一份 IP 制备物是指 4 x 106 个组织培养细胞或 25 mg 离体的组织。
!! 这就表示，进行操作前稀释缓冲液是重要的一步。
安全停止 如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。

I. 组织交联和样品制备

当收获组织时，去除样品上不需要的材料，如脂肪和坏死组织。随后可以立即处理并交联组织，或在干冰上冷冻并储存于 -80°C 以待稍后处理。为获得最佳的染色质产率和 ChIP 结果，每次进行免疫沉淀法测试时，使用 25 mg 的组织。不同组织类型的染色质产率也不尽相同，并且一些组织在每次免疫沉淀法测试需要超过 25 mg。有关不同组织类型的预期染色质产率的更多信息，请参见附录 A。额外需要一份染色质样品进行染色质消化和浓度分析（第四部分）。如果需要，应处理额外五份染色质样品，以最优化染色质消化（附录 B）。

在开始之前：

(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中 IP 制备物的数量成比例的增加。

  • 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) 和 10X Glycine Solution。确保 PIC 完全解冻。
  • 对每 25 mg 待处理组织，制备 3 ml 磷酸盐缓冲液 (PBS) + 15μl 200X PIC 并置于冰上。
  • 对于每 25 mg 待处理组织，制备 45μl 37% 甲醛并置于室温下贮存。在制造商规定的有效期内使用新鲜甲醛。

A. 交联

  1. 称重新鲜或冷冻的组织样品。每次免疫沉淀法使用 25 mg 组织进行实验（一次实验至少需要 75 mg 组织以包含阳性和阴性对照）。
  2. 将组织样品置于 60 mm 或 100 mm 培养皿中并用干净的解剖刀或剃须刀片切碎。将培养皿放在冰上。重要的是将组织置于低温下以防止蛋白质降解。
  3. 将切碎的组织转移至 15 ml 锥形试管。
  4. 对于每 25 mg 组织，添加 1 ml PBS+ PIC 到锥形试管。
  5. 为了使蛋白质与 DNA 交联，向每 1 ml PBS + PIC 中添加 45μl 37% 甲醛并在室温下振摇 20 分钟。甲醛最终浓度是 1.5%。
  6. 向每 1 ml PBS + PIC 中添加 100 μl 10X 甘氨酸以终止交联并在室温下混合 5 分钟。
  7. 将组织置于台式离心机中，在 4℃ 下以 500 x g 的速度离心 5 分钟。
  8. 移除上清液并用 1 ml PBS+ PIC/25 mg 组织洗涤一次。
  9. 将组织置于台式离心机中，在 4℃ 下以 500 x g 的速度重复离心 5 分钟。
  10. 移除上清液，对于每 25 mg 组织，将组织重悬于 1 ml PBS + PIC 中并置于冰上贮存。使用 Medimachine（B 部分）或 Dounce 匀浆器（C 部分），将组织分离成单细胞悬液。（安全停止）或者，样本裂解前在 -80°C 条件下最多可保存 3 个月。

B. 使用 BD Biosciences 的 Medimachine（部件号 340587）离散组织

  1. 切去 1000 μL 移液器吸头的末端以扩大开口，用以转移组织块。
  2. 将 1 ml 重悬于 PBS + PIC 中的组织转移到 50 mm Medicone（部件号 340592）的顶部室。
  3. 根据制造商的说明，研磨组织 2 分钟。
  4. 使用 1 ml 注射器和 18 号钝头针，从 Medicone 的底部室收集细胞悬液。将细胞悬液转移至 15 ml 锥形试管并置于冰上。
  5. 重复步骤 2 至 4，直到全部组织均处理成均匀悬液。
  6. 如果需要更充分地碾磨，则向组织中添加更多的 PBS + PIC。重复步骤 2 至 5，直到全部组织均研磨成均匀悬液。
  7. 用显微镜检查单细胞悬液（可选）。
  8. 将组织置于台式离心机中，在 4℃ 下以 2,000 x g 的速度离心 5 分钟。
  9. 从细胞移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。

C. 使用 Dounce 匀浆器离散组织

  1. 将重悬于 PBS + PIC 中的组织转移至 Dounce 匀浆器。
  2. 敲击 20-25 次离散组织小片。用显微镜检查单细胞悬液（可选）。
  3. 将细胞悬液转移至 15 ml 锥形试管并置于台式离心机中在 4℃ 下以 2,000 x g 离心 5 分钟。
  4. 从细胞移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。

II. 细胞培养物交联和样品制备

为达到最佳染色质免疫沉淀法结果，每次免疫沉淀法使用大约 4 X 106 细胞进行实验（至少需要 12 X 106 个细胞以包含阳性和阴性对照）。对于 Hela 细胞，一次免疫沉淀相当于 15 cm 培养皿所含细胞（在 20 ml 生长培养基中的融合度为 90%）的一半。要进行染色质消化和浓度分析，应当处理一份额外样品（第四部分）。因为每种细胞类型都不相同，我们推荐您在实验中准备一盘额外的细胞，通过使用血球仪或细胞计数器确定细胞的数量。

在开始之前

(!) 所有缓冲液体积应根据使用的 15 cm 组织培养皿（或 20 ml 悬浮细胞）数量按比例增加。

  • 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 和 10X Glycine Solution #7005。确保 PIC 完全解冻。
  • 对于每个待处理的 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞），配制 2 ml 磷酸盐缓冲液 (PBS) + 10 μl 200X PIC，并放在冰上。
  • 对于每个待处理的 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞），配制 40 ml PBS，并放在冰上。
  • 对于每个待处理的 15 cm 培养皿（或 20 ml 悬浮细胞），配制 540 μl 37% 甲醛，并保存在室温下。在制造商规定的有效期内使用新鲜甲醛。
  1. 为让蛋白与 DNA 交联，每个含有 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿添加 540 μl 37% 甲醛。对于悬浮细胞，添加 540 µl 37% 甲醛到在 20 ml 培养基中悬浮的细胞中（如要对悬浮细胞进行最佳固定，固定时的细胞密度应少于 0.5 x 106 个细胞/ml）。短暂旋转混匀并置于室温下孵育 10 分钟。甲醛的最终浓度是 1%。添加甲醛可能导致培养基颜色发生变化。
  2. 每个含 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿添加 2 ml 10X 甘氨酸，稍微涡旋混合，并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能导致培养基颜色发生变化。
  3. 对于悬浮细胞，将细胞转移至 50 ml 锥形试管，置于台式离心机中在 4℃ 下以 500 x g 离心 5 分钟，并用 20 ml 冰冷的 PBS 洗涤沉淀物两次。移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。
  4. 对于贴壁细胞，移除培养基和用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞两次，每次都要从培养皿完全移除洗液。
  5. 每个 15 cm 培养皿添加 2 ml 冰冷的 PBS + PIC。将细胞刮入冷的缓冲液中。将所有培养皿的细胞混合放入一个 15 ml 锥形试管。
  6. 将细胞置于台式离心机中，在 4℃ 下以 2,000 x g 的速度离心 5 分钟。移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。（安全停止）或者，样本在 -80°C 条件下最多可保存 3 个月。

III. 胞核制备和染色质消化

在开始之前

(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中 IP 制备物的数量成比例的增加。

  • 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。使用前确保它完全融化。
  • 配制 1 M DTT (192.8 mg DTT #7016 + 1.12 ml dH2O)。确保 DTT 晶体完全溶解。

    (!!) 重要提示：一旦溶解，将 1 M DTT 置于 -20℃ 下存放。

  • 取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解。
  • 对于每份 IP 制备物，制备 1 ml 1X 缓冲液 A（250 μl 4X Buffer A #7006 + 750 μl 水） + 0.5 μl 1M DTT + 5 μl 200X PIC 并置于冰上。
  • 对于每份 IP 制备物，制备 1.1 ml 1X 缓冲液 B（275 μl 4X Buffer B #7007 + 825 μl 水） + 0.55 μl 1M DTT 并置于冰上。
  • 对于每份 IP 制备物，制备 100 μl 1X ChIP 缓冲液（10 μl 10X ChIP Buffer #7008 + 90 μl 水）+ 0.5 μl 200X PIC 并置于冰上。
  1. 对于每份 IP 制备物，将细胞重悬于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 A + DTT + PIC 中。在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟颠倒试管混匀。
  2. 将细胞置于台式离心机中，在 4℃ 下以 2,000 x g 的速度离心 5 分钟从而沉淀胞核。对于每份 IP 制备物，移除上清液并将沉淀物重悬于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 B + DTT 中。对于每份 IP 制备物，重复离心，移除上清液并将沉淀物重悬于 100 μl 1X 缓冲液 B + DTT。将样品转移至 1.5 ml 微量离心管，直至每支试管共装有 1 ml 样品。
  3. 向每份 IP 制备物中添加 0.5 μl Micrococcal Nuclease #10011，通过翻转离心管数次进行混合并且在 37℃ 下孵育 20 分钟，同时频繁搅拌，以使 DNA 消化成大约 150-900 bp 的长度。每 3 至 5 分钟翻转进行混合。对于各种组织和细胞系（参见附录 B），可能需要通过预实验确定将 DNA 消化成最佳长度所需 Micrococcal Nuclease 的量。用 0.5 μl Micrococcal Nuclease/4 x 106 个 Hela 细胞消化的胞核和用 0.5 μl Micrococcal Nuclease/25 mg 组织消化的小鼠肝组织产生了适当长度的 DNA 片段。
  4. 向每份 IP 制备物中添加 10 μl 0.5 M EDTA #7011 并将离心管置于冰上 1-2 分钟以终止消化。
  5. 置于微量离心机中，在 4℃ 下以 16,000 x g 离心 1 分钟，使胞核沉淀，并移除上清液。
  6. 对于每份 IP 制备物，将胞核沉淀物重悬于 100 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中并在冰上孵育 10 分钟。
  7. 对于每支 1.5 ml 微量离心管，用几个脉冲对至多 500 μl 裂解物进行声波处理，以破坏胞核膜。脉冲间隔将样品置于湿冰上孵育 30 秒。可以通过在光学显微镜下观察声波处理前后的胞核，确定完全裂解胞核所需的最佳条件。通过使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探头的 VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator，Hela 胞核在 3 组 20 秒脉冲之后完全裂解。或者，可以通过将裂解物置于 Dounce 匀浆器中搅匀 20 次，裂解胞核；但是，裂解可能不完全。
  8. 在 4°C 下用微量离心机以 9,400 x g 的离心力离心分离 10 分钟来使裂解物变澄清。
  9. 将上清液转移至新试管。（安全停止） 这是交联的染色质制备物，应当置于 -80 ℃ 下贮存直至进一步使用。取出 50 μl 染色质制备物进行染色质消化和浓度分析（第四部分）。这份 50 µl 的样本可以在 -20°C 下过夜保存。

IV. 染色质消化和浓度分析（建议的步骤）

  1. 向 50 μl 染色质样品（在第三部分的步骤 9 中制备）中添加 100 μl 无核酸酶水、6 μl 5M NaCl #7010 和 2 μl RNAse A #7013。涡旋混合，并在 37℃ 下孵育样品 30 分钟。
  2. 向每份经 RNAse A 消化的样品中添加 2 μl Proteinase K。摇晃混匀并在 65℃ 孵育样品 2 小时。
  3. 按第七部分中所述的步骤，使用 DNA 纯化离心柱从样品中纯化 DNA。（安全停止）DNA 样本在 -20°C 条件下最多可保存 6 个月。
  4. 在纯化 DNA 后，取出 10 μl 样品并将其与 100 bp DNA 标准品置于 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳以确定 DNA 片段的大小。应当将 DNA 消化成大约 150-900 bp 的长度（1 至 5 个核小体）。
  5. 为确定 DNA 浓度，将 2μl 纯化的 DNA 转移至 98 μl 无核酸酶水，以获得 50 倍稀释度并读取 OD260 值。DNA 浓度（以 μg/ml 计）为 OD260 x 2,500。最理想的 DNA 浓度应介于 50 和 200 µg/ml 之间。

注意：为了获得最佳的 ChIP 结果，适宜大小和合适浓度的染色质非常关键。染色质过度消化可能会在 PCR 定量时削弱信号。染色质消化不充分可能导致背景信号增加和分辨率降低。向 IP 中添加染色质过少可能导致在 PCR 定量时信号削弱。优化染色质消化的实验步骤可以在附录 B 中找到。

五、染色质免疫沉淀法

为了获得最佳的 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 μg 消化的交联染色质（如第四部分中所测定）。这应当和来自 25 mg 分散的组织或 4 x 106 个组织培养细胞的单一 100μl IP 制备物大致相等。在添加抗体之前，通常将 100μl 消化的染色质稀释到 400μl 1X ChIP 缓冲液中。但是，如果每次 IP 需要 100 μl 以上的染色质，则交联的染色质制备物不需要按照下述方法进行稀释。可以直接向未稀释的染色质制备物中添加抗体以对染色质复合体进行免疫沉淀测试。

在开始之前

(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。

  • 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。
  • 取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解。
  • 融化消化的染色质制备物（在第三部分的步骤 9 中制备）并置于冰上。
  • 制备低盐洗液：每次免疫沉淀法需使用 3 ml 1X ChIP 缓冲液（300 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 2.7 ml 水）。在室温下储存直至使用。
  • 制备高盐洗液：每次免疫沉淀法使用 1 ml 1X ChIP 缓冲液（100 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 900 µl 水） + 70 µl 5M NaCl #7010 在室温下储存直至使用。
  1. 在一支试管中，制备足量的 1X ChIP 缓冲液，以稀释消化的染色质，达到免疫沉淀所需的数量：每次免疫沉淀法需使用 400 µl 的 1X ChIP 缓冲液（40 µl 的 10X ChIP 缓冲液 + 360 µl 水）+ 2 µl 200X PIC。当确定免疫沉淀次数时，记得纳入阳性对照样品 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620 和阴性对照样品 Normal Rabbit IgG Antibody #2729。将混合物置于冰上。
  2. 对于每次免疫沉淀，向配置的 1X ChIP 缓冲液中添加 100 μl（5 至 10 μg 染色质）等量的消化的交联染色质制备物（在第三部分中的步骤 9 中制备）。例如，要进行 10 次免疫沉淀，需要准备一支含有 4 ml 1X ChIP 缓冲液（400 μl 10X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 μl 200X PIC + 1 ml 消化的染色质制备物的试管。
  3. 取出 10 μl 稀释的染色质样品并将其转移至微量离心管。这将作为 2% 样品输入对照，该样品在后续使用之前可以置于 -20℃ 下贮存（第六部分的步骤 1 ）。
  4. 对于每次免疫沉淀，将 500 μl 稀释的染色质转移至 1.5 ml 微量离心管并添加免疫沉淀抗体。每次 IP 需要的抗体量不定而且应当由使用者确定。对于阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620，向 IP 样品中添加 10 μl。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729，向 IP 样品中添加 1μl (1 μg) 至 2 μl (2 μg)。如果使用 Cell Signaling Technology 的抗体，请参考数据手册或产品网页上列出的推荐稀释比例，并根据 Cell Signaling 抗体浓度计算 IgG 抗体的量 (µg) 作为阴性对照，这样才能公正的比较。将 IP 样品在 4℃ 下转动孵育 4 小时至过夜。

    注意：Cell Signaling Technology 抗体在每份处于 1 和 2 ug 之间 IP 样品会取得最佳效果。当存在多份不同浓度的样品时，最好使阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。

  5. 轻轻涡旋混合，重悬 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006。立即向每 IP 反应中添加 30 μl Protein G Magnetic Beads 并在 4°C 下转动孵育 2 小时。
  6. 将试管置于 Magnetic Separation Rack #7017 上，使每次免疫沉淀中的 Protein G Magnetic Beads 沉淀。等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清，然后小心地移除上清液。
  7. 向微珠中添加 1 ml 低盐洗液，对 Protein G Magnetic Beads 进行洗涤，然后在 4°C 下转动孵育 5 分钟。再重复步骤 6 和 7 两次，以确保总共进行 3 次低盐洗涤。
  8. 向微珠中添加 1 ml 高盐洗液并且在 4℃ 下转动孵育 5 分钟。
  9. 将试管置于 Magnetic Separation Rack 上，使每次免疫沉淀中的 Protein G Magnetic Beads 沉淀。等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清，然后小心地移除上清液。立即进入第六部分。

VI. 将染色质从抗体/Protein G Magnetic Beads 上洗脱下来并解交联

在开始之前

(!) 所有缓冲液的用量都应按照实验中免疫沉淀物的数量成比例的增加。

  • 取出 2X ChIP Elution Buffer #7009 并置于 37℃ 水浴中加热，并确保 SDS 溶解。
  • 将水浴或热混合仪设为 65℃。
  • 对于每次免疫沉淀和 2% 样品输入对照，制备 150μl 1X ChIP 洗脱缓冲液（75 μl 2X ChIP Elution Buffer #7009 + 75 μl 水）。
  1. 向 2% 样品输入对照管中添加 150 μl 1X ChIP 洗脱缓冲液并置于室温下直至开始进行步骤 6。
  2. 向每份 IP 样品中添加 150 μl 1X ChIP 洗脱缓冲液。
  3. 轻轻涡旋混合（1,200 转/分钟）并在 65°C 下孵育 30 分钟以将染色质从抗体/Protein G Magnetic Beads 上洗脱下来。对于这个步骤，热混合仪效果最佳。或者，可以在室温下转动洗脱，但是可能不会完全洗脱。
  4. 将试管置于磁性分离架中使 Protein G Magnetic Beads 沉淀，然后等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清。
  5. 小心地将洗脱下来的染色质上清液转移至新试管。
  6. 向所有试管（包括步骤 1 中的 2% 输入样品）中添加 6 μl 5M NaCl 和 2 μl Proteinase K #10012 解交联，并在 65 °C 下孵育 2 小时。这次孵育可以延长过夜。
  7. 立即进入第七部分。(安全停止) 或者，样本在 -20°C 条件下最多可保存 4 天。然而，为了避免形成沉淀物，确保在添加 DNA Binding Buffer #10007 之前，将样品加热到室温（第七部分，步骤 1）。

VII. 使用离心柱纯化 DNA

在开始之前

  • (!!) 使用前向 DNA Wash Buffer #10008 中添加 24 ml 乙醇 (96-100%)。此操作仅需在第一次DNA纯化前进行。
  • 对于第五部分制备的每份 DNA 样品，取出一支 DNA 纯化收集管 #10010。
  1. 向每份 DNA 样品中添加 750 μl DNA Binding Buffer #10007 并短暂涡旋混合。
    • 对于每 1 体积样品，应当使用 5 倍体积的 DNA 结合缓冲液。
  2. 从在步骤 1 中制备的每份样品中取出 450 μl 并将其至收集管的 DNA 离心柱中。
  3. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
  4. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
  5. 从在步骤 1 中制备的每份样品中取出剩余的 450 μl 并将其转移至收集管的离心柱中。重复步骤 3 和 4。
  6. 向收集管的离心柱中添加 750 μl DNA Wash Buffer #10008。
  7. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
  8. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
  9. 用离心机以 18,500 x g 离心 30 秒。
  10. 丢弃收集管和液体。保留离心柱。
  11. 向每个离心柱中添加 50 μl DNA Elution Buffer #10009 并将其置于洁净的 1.5 ml 微量离心管中。
  12. 用微量离心机以 18,000 x g 的离心力离心分离 30 秒，以洗脱 DNA。
  13. 取出并丢弃 DNA 离心柱。洗脱物即纯化的 DNA。（安全停止） 样本可以在 -20°C 条件下保存。

八、用 PCR 定量 DNA

建议

  • 使用带滤嘴的移液器吸头，从而最大限度地减少污染风险。
  • 试剂盒中所含的对照引物专门用于人或小鼠 RPL30 基因（#7014 + #7015）并且可以用于标准 PCR 或实时荧光定量 PCR。如果使用者进行的是另一个物种的 ChIP，则建议使用者针对 DNA 设计适宜的特异性引物并确定最佳的 PCR 条件。
  • 建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度降低非特异性 PCR 产物的风险。
  • PCR 引物选择至关重要。应当严格遵循以下标准设计引物：
引物长度： 24 个核苷酸
最佳 Tm： 60℃
最佳 GC： 50%
扩增子尺寸： 150 至 200 bp（标准 PCR）
80 至 160 bp（实时荧光定量 PCR）

标准 PCR 方法

  1. 根据待分析样品的数量，标记适宜数量的 0.2 ml PCR 管。这些样品应当包括 2% 样品输入对照、阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照 Normal Rabbit IgG 样品，和未加入 DNA 的试管以排除 DNA 污染。
  2. 向每支管中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
  3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物，配置时多配置两个样本的试剂以弥补分管时的体积损耗。向每支反应管中添加 18 μl 主混合物。
试剂 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl)
无核酸酶的 H2O 12.5 μl
10X PCR 缓冲液 2.0 μl
4mM dNTP 混合物 1.0 μl
5 μM RPL30 引物 2.0 μl
Taq DNA 聚合酶 0.5 μl
  1. 启动以下 PCR 反应程序：
a. 初始变性 95℃ 5 分钟
b. 变性 95℃ 30 秒
c. 复性 62℃ 30 秒
d. 延伸 72℃ 30 秒
e. 重复步骤 b-d，共循环 34 次。
f. 终末延伸 72℃ 5 分钟
  1. 从每支反应管中取出 10 μl PCR 产物，使其与 100 bp DNA 标准品同时进行 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，以进行分析。人 RPL30 #7014 和小鼠 RPL30 #7015 的 PCR 产物预期大小分别是 161 bp 和159 bp。

实时定量 PCR 方法

  1. 标记适当数量、兼容待用 PCR 仪型号的 PCR 管或 PCR 平板。PCR 反应应当包括阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照 Normal Rabbit IgG 样品、监控 DNA 污染的不含 DNA 模板的试管和 2% 输入对照组染色质 DNA 的连续稀释物（未稀释、1:5、1:25、1:125），以生成标准曲线并测定扩增效率。
  2. 向 PCR 平板上的每只管或每个孔中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
  3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物。额外足量配置两个反应的试剂以弥补分管时的体积损失。向每支 PCR 反应管或每个孔中添加 18 μl 反应混合物。（安全停止）如有必要用铝箔纸盖住平板以避光，并在 4°C 下最多保存 4 小时或在 -20°C 下过夜，直到机器可以使用。
试剂 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl)
无核酸酶的 H2O 6 μl
5 μM RPL30 引物 2 μl
SimpleChIP® Universal qPCR Master Mix #88989 10 μl
  1. 启动以下 PCR 反应程序：
a. 初始变性 95℃ 3 分钟
b. 变性 95℃ 15 秒
c. 复性和延伸： 60℃ 60 秒
d. 重复步骤 b 和 c，共循环 40 次。

  1. 使用实时 PCR 仪的自带软件，分析定量 PCR 结果。或者，可以使用输入样品百分数方法和以下所示的公式，手动计算 IP 效率。采用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表述为占总输入样品染色质的百分比。

    输入百分比 = 2% x 2（C[T] 2% 输入样品 – C[T] IP 样品）

    C[T] = CT = PCR 反应的阈周期

九、NG-Sequencing文库构建

用这种试剂盒制备的免疫富集的 DNA 样品可用于 ChIP-seq 。要构建下游 NG 测序用 DNA 文库，请使用与您的下游测序平台相容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。如要在 Illumina® 平台上进行测序，我们建议使用 SimpleChIP® ChIP-seq DNA Library Prep Kit for Illumina® #56795 及其相关索引引物 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Single Index Primers) #29580 或 SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina® (Dual Index Primers) #47538。

建议：

  • 对于转录因子或辅因子 ChIP-seq，使用至少 5 ng ChIP 富集的 DNA 和 10 个 PCR 循环扩增衔接子连接的 DNA。
  • 对于总组蛋白和组蛋白修饰或样品输入对照，开始时使用至少 50ng ChIP 富集的 DNA 和 6 个 PCR 循环扩增衔接子连接的 DNA。
  • 要对全部靶标类型的 ChIP-富集的 DNA 构建文库，需对衔接子连接的 DNA 进行纯化，但无需进行大小选择。
  • 在构建 DNA 文库之后，使用 Agilent High Sensitivity DNA Kit （Agilent Technologies，货号：G2938-90322）或通过与 50-100 ng DNA 在 2% 琼脂糖 TAE 凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳，来检验 DNA 文库中衔接子二聚体（约 140 bp）是否存在。如果 DNA 文库中存在衔接子二聚体，则重复 PCR 扩增材料的纯化。
  • 也可通过对已知阳性和阴性靶基因座使用 qPCR 和引物组来确认文库的质量。与阴性引物相比，阳性引物对仍然应当产生相同的高信号，如原始 qPCR 分析 ChIP 富集的 DNA 时所见。
  • 完成最终的纯化和质量检验后，制备浓度为 2-10 nM 的最终纯化文库样品以用于高通量测序。

附录 A：预期的染色质产量

从组织样品收获交联的染色质时，组织类型之间的染色质产率可能显著不同。右表显示了用 25 mg 组织（类似于 4 x 106 个 Hela 细胞）制备的染色质预期产率和预期 DNA 浓度的范围，该产率和浓度按实验步骤第四部分的方法测定。对于每种组织类型，使用 Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器离散获得了相似数量的染色质。但是，与用通过 Dounce 匀浆器离散的组织制备和处理的染色质相比，用通过 Medimachine 离散的组织制备和处理的染色质通常具有更高的 IP 效率。强烈推荐 Dounce 匀浆器用于离散脑组织，原因是 Medimachine 无法将脑组织充分分离成单细胞悬液。为了获得最佳的 ChIP 结果，我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 μg 消化的交联染色质，因此，对于某些组织，每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。

组织/细胞 染色质总产率 预期 DNA 浓度
脾 20-30 μg/25 mg 组织 200-300 μg/ml
肝 10-15 μg/25 mg 组织 100-150 μg/ml
肾 8-10 μg/25 mg 组织 80-100 μg/ml
脑 2-5 μg/25 mg 组织 20-50 μg/ml
心脏 2-5 μg/25 mg 组织 20-50 μg/ml
Hela 10-15 μg/4 x 106 个细胞 100-150 μg/ml

附录 B：染色质消化的优化

将交联的染色质 DNA 消化成 150-900 个碱基对长度的最佳条件高度取决于 Micrococcal Nuclease 对消化中所用组织量或细胞数目的比率。以下是确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的实验步骤。

  1. 如第一、二和三部分中所述，从125 mg 组织或 2 X 107 个细胞（等同于 5 份 IP 制备物）制备交联的胞核。在第三部分的步骤 2 之后停止，并如下所述继续。
  2. 将 100 μl 胞核制备物转移入 5 个独立的 1.5 ml 微量离心管中，然后置于冰上。
  3. 向 27 μl 1X 缓冲液 B + DTT（1:10 酶稀释度）中添加 3 μl Micrococcal Nuclease 原液。
  4. 向步骤 2 中 5 支离心管的每支试管中添加 0 μl、2.5 μl、5 μl、7.5 μl 或 10 μl 稀释的 Micrococcal Nuclease，翻转离心管数次进行混合，然后在 37°C 下孵育 20 分钟，同时频繁混合。
  5. 添加 10 μl 0.5 M EDTA 并将离心管置于冰上以终止消化。
  6. 置于微量离心机中，在 4℃ 下以 16,000 x g 离心 1 分钟，使胞核沉淀，并移除上清液。
  7. 将胞核沉淀物用 200 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 重悬。在冰上孵育 10 分钟。
  8. 用几个脉冲对裂解物进行声波处理以破坏胞核膜。脉冲间期，将样品置于湿冰上孵育 30 秒。可以通过在光学显微镜下观察声波处理前后的胞核，确定完全裂解胞核所需的最佳条件。通过使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探头的 VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator，Hela 胞核在 3 组 20 秒的脉冲之后完全裂解。或者，可以通过将裂解物置于 Dounce 匀浆器中搅匀 20 次，裂解胞核；但是，裂解可能不完全。
  9. 在 4°C 下用微量离心机以 9,400 x g 的离心力离心分离 10 分钟来使裂解物变澄清。
  10. 从每份超声处理的裂解物中取出 50 μl 转移至新的微量离心管。
  11. 向每份 50 μl 的样品中添加 100 μl 无核酸酶水、6 μl 5 M NaCl 和 2 μl RNAse A。涡旋混合并在 37°C 下孵育 30 分钟。
  12. 向每份 RNAse A 消化的样品中添加 2 μl Proteinase K。涡旋混合并在 65°C 下将样品孵育 2 小时。
  13. 从每份样品取出 20 μl，使其与 100 bp DNA 标准品在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳以确定 DNA 片段大小。
  14. 观察哪个消化条件能够产生所需 150-900 碱基对（1 至 5 个核小体）范围内的 DNA。优化实验步骤中能够获得所需 DNA 片段大小的 Micrococcal Nuclease 的稀释体积等于需添加至一份免疫沉淀制备物（25 mg 离散的组织细胞或 4 X 106 个组织培养细胞）以获得所需 DNA 片段大小的 Micrococcal Nuclease 原液体积的 10 倍。例如，如果在这个实验步骤中，5 μl 稀释的微球菌核酸酶产生 150-900 碱基对的 DNA 片段，则应当在第 III 部分中染色质消化期间添加 0.5 μl 微球菌核酸酶原液至一份 IP 制备物。
  15. 如果结果表明 DNA 的大小未在所需的范围内，则重复优化实验步骤，每次消化中相应调节 Micrococcal Nuclease 的量。或者，可以改变消化时间以提高或降低 DNA 片段化的程度。

附录 C：故障排除指南

问题 可能的原因 建议
1. 消化的染色质浓度过低。 添加至染色质消化的细胞数不足，或者胞核在消化后未完全裂解。

如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml，则向每次 IP 中添加额外的染色质以确保每次 IP 至少产生 5 μg，然后继续实验。

在交联之前计算备用平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量，和/或在声波处理前后在显微镜下观察胞核，以证实胞核完全裂解。
2. 染色质消化不足且片段过大（大于 900 bp）。

细胞可能已经过度交联。交联超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。

向染色质消化中添加过多细胞或未添加足够的 Micrococcal Nuclease。

在甲醛浓度固定的情况下进行一段时间。将交联时间缩短至 10 分钟或更短。

在交联之前计算备用平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量；有关染色质消化的优化，参见附录 B。
3. 染色质过度消化并且片段过小（只有 150 bp 单核小体的长度）。在 PCR 定量期间，将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能削弱信号，尤其对于长度大于 150 bp 的扩增子更是如此。 添加至染色质消化的细胞不足或 Micrococcal Nuclease 过多。 在交联之前计算备用平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量；有关染色质消化的优化，参见附录 B。
4. 样品输入对照组 PCR 反应中无产物或产物很少。

添加至 PCR 反应的 DNA 不足或条件不是最佳。

PCR 扩增区域可能跨越无核小体的区域。

添加至 IP 反应的染色质不足或染色质过度消化。

向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。

使用来自交联并消化后的染色质的纯化 DNA，优化实验引物组的 PCR 条件。设计不同的引物组并将扩增子的长度减少到小于 150 碱基对（请参见第八部分中的引物设计建议）。

为获得最佳 ChIP 结果，每次 IP 添加 5-10 μg 染色质。参见上述问题 1 和 3 的建议。
5. 阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中无产物。

添加至 IP 反应的染色质或抗体不足，或者 IP 孵育时间过短。

蛋白 G 微珠中染色质洗脱不完全。

确保向每次 IP 反应中添加 5-10 μg 染色质和 10 μl 抗体并和抗体一起孵育过夜。在添加蛋白 G 微珠后需额外孵育 2 小时。

在 65℃ 下将染色质从蛋白 G 微珠洗脱为最佳，同时频繁混合以保持微珠悬浮在溶液中。
6. 阴性对照 Rabbit IgG-IP 和阳性对照 Histone H3-IP PCR 反应中产物的数量相等。

添加至 IP 反应的染色质过多或不足。或者，添加至 IP 反应的抗体过多。

添加至 PCR 反应的 DNA 过多或扩增循环次数过多。

向每次 IP 反应中添加不超过 15 μg 的染色质和 10 μl Histone H3 Antibody。每次 IP 将 Normal Rabbit IgG 缩减至1 µl/IP。

向 PCR 反应中添加更少的 DNA 或减少 PCR 循环次数。在 PCR 的线性扩增阶段范围内分析 PCR 产物极为重要。否则，不能准确测量起始 DNA 数量的差异。
7. 实验抗体 IP PCR 反应中无产物。

添加至 PCR 反应的 DNA 不足。

添加至 IP 反应的抗体不足。

抗体不适用于 IP。

向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。

通常，需向 IP 反应中添加 1 至 5 µg 的抗体；但是，实际加入量很大程度上取决于各个抗体本身。

增加添加至 IP 反应的抗体量。寻找其他替代抗体。

发布​于 2011 年 12 月 

修订于 2018 年 6 月

实验步骤编号：82

染色质免疫沉淀法

特定产品: SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005。

所需的试剂

包括的试剂：

  1. Glycine Solution (10X) #7005
  2. Buffer A (4X) #7006
  3. Buffer B (4X) #7007
  4. ChIP Buffer (10X) #7008
  5. ChIP Elution Buffer (2X) #7009
  6. 5 M NaCl #7010
  7. 0.5 M EDTA #7011
  8. ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006
  9. DNA Binding Buffer #10007
  10. DNA Wash Buffer（使用前添加 4x 体积乙醇）#10008
  11. DNA Elution Buffer #10009
  12. DNA Purification Columns #10010
  13. Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012
  14. RNAse A (10 mg/ml) #7013
  15. Micrococcal Nuclease（2000 凝胶单位/µl）#10011
  16. Proteinase K (20 mg/ml) #10012
  17. SimpleChIP® Human RPL30 Exon 3 Primers 1 #7014
  18. SimpleChIP® Mouse RPL30 Intron 2 Primers 1 #7015
  19. Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620
  20. Normal Rabbit IgG #2729
  21. DTT (Dithiothreitol) #7016

未包括的试剂：

  1. Magnetic Separation Rack #7017 / 14654
  2. Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872
  3. Nuclease-free Water #12931
  4. 乙醇 (96-100%)
  5. 甲醛（37% 母液）
  6. Taq DNA 聚合酶
  7. dNTP 混合物

I. 组织交联和样品制备

当收获组织时，去除样品上不需要的材料，如脂肪和坏死组织。随后可以立即处理并交联组织，或在干冰上冷冻以待稍后处理。为获得最佳的染色质产率和 ChIP 结果，每次进行免疫沉淀法测试时，使用 25 mg 的组织。不同组织类型的染色质产率也不尽相同，并且一些组织在每次免疫沉淀法测试需要超过 25 mg。有关不同组织类型的预期染色质产率的更多信息，请参见附录 A。额外需要一份染色质样品进行染色质消化和浓度分析（第四部分）。

在开始之前：

  • 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) 和 10X Glycine Solution。确保 PIC 完全解冻。
  • 对每 25 mg 待处理组织，制备 3 ml 磷酸盐缓冲液 (PBS) + 15μl 200X PIC 并置于冰上。
  • 对于每 25 mg 待处理组织，制备 45μl 37% 甲醛并置于室温下贮存。在制造商规定的有效期内使用新鲜甲醛。

A. 交联

  1. 称重新鲜或冷冻的组织样品。对于每次要操作的 IP，使用 25 mg 组织。
  2. 将组织样品置于 60 mm 或 100 mm 培养皿中并用干净的解剖刀或剃须刀片切碎。将培养皿放在冰上。重要的是将组织置于低温下以防止蛋白质降解。
  3. 将切碎的组织转移至 15 ml 锥形试管。
  4. 对于每 25 mg 组织，添加 1 ml PBS+ PIC 到锥形试管。
  5. 为了使蛋白质与 DNA 交联，向每 1 ml PBS + PIC 中添加 45μl 37% 甲醛并在室温下振摇 20 分钟。甲醛最终浓度是 1.5%。
  6. 向每 1 ml PBS + PIC 中添加 100 μl 10X 甘氨酸以终止交联并在室温下混合 5 分钟。
  7. 将组织置于台式离心机中，在 4℃ 下以 1,500 转/分钟的速度离心 5 分钟。
  8. 移除上清液并用 1 ml PBS+ PIC/25 mg 组织洗涤一次。
  9. 置于台式离心机中，在 4℃ 下以 1,500 转/分钟重复离心 5 分钟。
  10. 移除上清液，对于每 25 mg 组织，将组织重悬于 1 ml PBS + PIC 中并置于冰上贮存。使用 Medimachine（B 部分）或 Dounce 匀浆器（C 部分），将组织分离成单细胞悬液。

B. 使用 BD Biosciences 的 Medimachine（部件号 340587）离散组织

  1. 切去 1000 μL 移液器吸头的末端以扩大开口，用以转移组织块。
  2. 将 1 ml 重悬于 PBS + PIC 中的组织转移到 50 mm Medicone（部件号 340592）的顶部室。
  3. 根据制造商的说明，研磨组织 2 分钟。
  4. 使用 1 ml 注射器和 18 号钝头针，从 Medicone 的底部室收集细胞悬液。将细胞悬液转移至 15 ml 锥形试管并置于冰上。
  5. 重复步骤 2 至 4，直到全部组织均处理成均匀悬液。
  6. 如果需要更充分地碾磨，则向组织中添加更多的 PBS + PIC。重复步骤 2 至 5，直到全部组织均研磨成均匀悬液。
  7. 用显微镜检查单细胞悬液（可选）。
  8. 将细胞置于台式离心机中，在 4℃ 下以 1,500 转/分钟离心 5 分钟。
  9. 从细胞移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。

C. 使用 Dounce 匀浆器离散组织

  1. 将重悬于 PBS + PIC 中的组织转移至 Dounce 匀浆器。
  2. 敲击 20-25 次离散组织小片。用显微镜检查单细胞悬液（可选）。
  3. 将细胞悬液转移至 15 ml 锥形试管并置于台式离心机中在 4℃ 下以 1,500 转/分钟离心 5 分钟。
  4. 从细胞移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。

II. 细胞培养物交联和样品制备

为了获得最佳 ChIP 结果，对于每次将要进行免疫沉淀法测试，使用大约 4 X 106 个细胞。对于 Hela 细胞，这相当于 15 cm 培养皿所含细胞（在 20 ml 生长培养基中的融合度为 90 %）的一半。要进行染色质消化和浓度分析，应当处理一份额外样品（第四部分）。在实验中额外使用一培养皿的细胞，以便使用血细胞计数器测量细胞数目。

在开始之前

  • 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012 和 10X Glycine Solution #7005。确保 PIC 完全解冻。
  • 对于每个待处理的 15 cm 培养皿，配制 2 ml 磷酸盐缓冲液 (PBS) + 10 μl 200X PIC，并放在冰上。
  • 对于每个待处理的 15 cm 培养皿，配制 40 ml PBS，并放在冰上。
  • 对于每个待处理的 15 cm 细胞培养皿，配制 540 μl 37% 甲醛，并保存在室温下。在制造商规定的有效期内使用新鲜甲醛。
  1. 为让蛋白与 DNA 交联，每个含有 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿添加 540 μl 37% 甲醛。短暂旋转混匀并置于室温下孵育 10 分钟。甲醛的最终浓度是 1%。添加甲醛可能导致培养基颜色发生变化。
  2. 每个含 20 ml 培养基的 15 cm 培养皿添加 2 ml 10X 甘氨酸，稍微涡旋混合，并在室温下孵育 5 分钟。添加甘氨酸可能导致培养基颜色发生变化。
  3. 对于悬浮细胞，将细胞转移至 50 ml 锥形试管，置于台式离心机中在 4℃ 下以 1,500 转/分钟离心 5 分钟，并用 20 ml 冰冷的 PBS 洗涤沉淀物两次。移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。
  4. 对于贴壁细胞，移除培养基和用 20 ml 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞两次，每次都要从培养皿完全移除洗液。
  5. 每个 15 cm 培养皿添加 2 ml 冰冷的 PBS + PIC。将细胞刮入冷的缓冲液中。将所有培养皿的细胞混合放入一个 15 ml 锥形试管。
  6. 将细胞置于台式离心机中，在 4℃ 下以 1,500 转/分钟离心 5 分钟。移除上清液，紧接着进行胞核制备和染色质消化（第三部分）。

III. 胞核制备和染色质消化

一份免疫沉淀制备物（IP 制备物）是指 25 mg 离散的组织或 4 x 106 个组织培养细胞。

在开始之前

  • 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。使用前确保它完全融化。

  • 配制 1 M DTT (192.8 mg DTT #7016 + 1.12 ml dH2O)。确保 DTT 晶体完全溶解。

    重要提示：一旦溶解，将 1 M DTT 置于 -20℃ 下存放。

  • 取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解。
  • 对于每份 IP 制备物，制备 1 ml 1X 缓冲液 A（250 μl 4X Buffer A #7006 + 750 μl 水） + 0.5 μl 1M DTT + 5 μl 200X PIC 并置于冰上。
  • 对于每份 IP 制备物，制备 1.1 ml 1X 缓冲液 B（275 μl 4X Buffer B #7007 + 825 μl 水） + 0.55 μl 1M DTT 并置于冰上。
  • 对于每份 IP 制备物，制备 100 μl 1X ChIP 缓冲液（10 μl 10X ChIP Buffer #7008 + 90 μl 水）+ 0.5 μl 200X PIC 并置于冰上。
  1. 对于每份 IP 制备物，将细胞重悬于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 A + DTT + PIC 中。在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟颠倒试管混匀。
  2. 置于台式离心机，在 4℃ 下以 3,000 转/分钟离心 5 分钟，使胞核沉淀。对于每份 IP 制备物，移除上清液并将沉淀物重悬于 1 ml 冰冷的 1X 缓冲液 B + DTT 中。对于每份 IP 制备物，重复离心，移除上清液并将沉淀物重悬于 100 μl 1X 缓冲液 B + DTT。将样品转移至 1.5 ml 微量离心管，直至每支试管共装有 1 ml 样品。
  3. 向每份 IP 制备物中添加 0.5 μl Micrococcal Nuclease #10011，通过翻转离心管数次进行混合并且在 37℃ 下孵育 20 分钟，同时频繁搅拌，以使 DNA 消化成大约 150-900 bp 的长度。每 3 至 5 分钟翻转进行混合。对于各种组织和细胞系（参见附录 B），可能需要通过预实验确定将 DNA 消化成最佳长度所需 Micrococcal Nuclease 的量。用 0.5 μl Micrococcal Nuclease/4 x 106 个 Hela 细胞消化的胞核和用 0.5 μl Micrococcal Nuclease/25 mg 组织消化的小鼠肝组织产生了适当长度的 DNA 片段。
  4. 向每份 IP 制备物中添加 10 μl 0.5 M EDTA #7011 并将离心管置于冰上以终止消化。
  5. 置于微量离心机中，在 4℃ 下以 13,000 转/分钟离心 1 分钟，使胞核沉淀，并移除上清液。
  6. 对于每份 IP 制备物，将胞核沉淀物重悬于 100 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中并在冰上孵育 10 分钟。
  7. 对于每支 1.5 ml 微量离心管，用几个脉冲对至多 500 μl 裂解物进行声波处理，以破坏胞核膜。脉冲间隔将样品置于湿冰上孵育 30 秒。可以通过在光学显微镜下观察声波处理前后的胞核，确定完全裂解胞核所需的最佳条件。通过使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探头的 VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator，Hela 胞核在 3 组 20 秒脉冲之后完全裂解。或者，可以通过将裂解物置于 Dounce 匀浆器中搅匀 20 次，裂解胞核；但是，裂解可能不完全。
  8. 通过在微量离心机中在 4℃ 下以 10,000 转/分钟离心 10 分钟，使裂解物变得澄清。
  9. 将上清液转移至新试管。该上清液即是交联的染色质制备物，应当置于 -80 ℃ 下贮存直至进一步使用。取出 50 μl 染色质制备物进行染色质消化和浓度分析（第四部分）。

IV. 染色质消化和浓度分析（建议的步骤）

  1. 向 50 μl 染色质样品（在第三部分的步骤 9 中制备）中添加 100 μl 无核酸酶水、6 μl 5M NaCl #7010 和 2 μl RNAse A #7013。涡旋混合，并在 37℃ 下孵育样品 30 分钟。
  2. 向每份经 RNAse A 消化的样品中添加 2 μl Proteinase K。摇晃混匀并在 65℃ 孵育样品 2 小时。
  3. 按第七部分中所述的步骤，使用 DNA 纯化离心柱从样品中纯化 DNA。
  4. 在纯化 DNA 后，取出 10 μl 样品并将其与 100 bp DNA 标准品置于 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳以确定 DNA 片段的大小。应当将 DNA 消化成大约 150-900 bp 的长度（1 至 5 个核小体）。
  5. 为确定 DNA 浓度，将 2μl 纯化的 DNA 转移至 98 μl 无核酸酶水，以获得 50 倍稀释度并读取 OD260 值。DNA 浓度（以 μg/ml 计）为 OD260 x 2,500。最理想的 DNA 浓度应介于 50 和 200 µg/ml 之间。

注意：为了获得最佳的 ChIP 结果，适宜大小和合适浓度的染色质非常关键。染色质过度消化可能会在 PCR 定量时削弱信号。染色质消化不充分可能导致背景信号增加和分辨率降低。向 IP 中添加染色质过少可能导致在 PCR 定量时信号削弱。优化染色质消化的实验步骤可以在附录 B 中找到。

五、染色质免疫沉淀法

为了获得最佳的 ChIP 结果，每次免疫沉淀使用大约 5 至 10 μg 消化的交联染色质（如第四部分中所测定）。这应当和来自 25 mg 分散的组织或 4 x 106 个组织培养细胞的单一 100μl IP 制备物大致相等。在添加抗体之前，通常将 100μl 消化的染色质稀释到 400μl 1X ChIP 缓冲液中。但是，如果每次 IP 需要 100 μl 以上的染色质，则交联的染色质制备物不需要按照下述方法进行稀释。可以直接向未稀释的染色质制备物中添加抗体以对染色质复合体进行免疫沉淀测试。

在开始之前

  • 取出并预热 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。确保 PIC 完全解冻。
  • 取出并加热 10X ChIP Buffer #7008 并确保 SDS 完全溶解。
  • 融化消化的染色质制备物（在第三部分的步骤 9 中制备）并置于冰上。
  • 制备低盐洗液：每次免疫沉淀法需使用 3 ml 1X ChIP 缓冲液（300 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 2.7 ml 水）。在室温下储存直至使用。
  • 制备高盐洗液：每次免疫沉淀法使用 1 ml 1X ChIP 缓冲液（100 µl 10X ChIP 缓冲液 #7008 + 900 µl 水） + 70 µl 5M NaCl #7010 在室温下储存直至使用。
  1. 在一支试管中，制备足量的 1X ChIP 缓冲液，以稀释消化的染色质，达到免疫沉淀所需的数量：每次免疫沉淀法需使用 400 µl 的 1X ChIP 缓冲液（40 µl 的 10X ChIP 缓冲液 + 360 µl 水）+ 2 µl 200X PIC。当确定免疫沉淀次数时，记得纳入阳性对照样品 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620 和阴性对照样品 Normal Rabbit IgG Antibody #2729。将混合物置于冰上。
  2. 对于每次免疫沉淀，向配置的 1X ChIP 缓冲液中添加 100 μl（5 至 10 μg 染色质）等量的消化的交联染色质制备物（在第三部分中的步骤 9 中制备）。例如，要进行 10 次免疫沉淀，需要准备一支含有 4 ml 1X ChIP 缓冲液（400 μl 10X ChIP 缓冲液 + 3.6 ml 水）+ 20 μl 200X PIC + 1 ml 消化的染色质制备物的试管。
  3. 取出 10 μl 稀释的染色质样品并将其转移至微量离心管。这将作为 2% 样品输入对照，该样品在后续使用之前可以置于 -20℃ 下贮存（第六部分的步骤 1 ）。
  4. 对于每次免疫沉淀，将 500 μl 稀释的染色质转移至 1.5 ml 微量离心管并添加免疫沉淀抗体。每次 IP 需要的抗体量不定而且应当由使用者确定。对于阳性对照 Histone H3 (D2B12) XP® Rabbit mAb #4620，向 IP 样品中添加 10 μl。对于阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729，向 IP 样品中添加 1μl (1 μg) 至 2 μl (2 μg)。将 IP 样品在 4℃ 下转动孵育 4 小时至过夜。

注意：Cell Signaling Technology 抗体在每份处于 1 和 2 ug 之间 IP 样品会取得最佳效果。当存在多份不同浓度的样品时，最好使阴性对照 Normal Rabbit IgG #2729 与最高抗体浓度相匹配。

  1. 轻轻涡旋混合，重悬 ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads #9006。立即向每 IP 反应中添加 30 μl Protein G Magnetic Beads 并在 4°C 下转动孵育 2 小时。
  2. 将试管置于 Magnetic Separation Rack #7017 上，使每次免疫沉淀中的 Protein G Magnetic Beads 沉淀。等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清，然后小心地移除上清液。
  3. 向微珠中添加 1 ml 低盐洗液，对 Protein G Magnetic Beads 进行洗涤，然后在 4°C 下转动孵育 5 分钟。再重复步骤 6 和 7 两次，以确保总共进行 3 次低盐洗涤。
  4. 向微珠中添加 1 ml 高盐洗液并且在 4℃ 下转动孵育 5 分钟。
  5. 将试管置于 Magnetic Separation Rack 上，使每次免疫沉淀中的 Protein G Magnetic Beads 沉淀。等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清，然后小心地移除上清液。立即进入第六部分。

VI. 将染色质从抗体/Protein G Magnetic Beads 上洗脱下来并解交联

在开始之前

  • 取出 2X ChIP Elution Buffer #7009 并置于 37℃ 水浴中加热，并确保 SDS 溶解。
  • 将水浴或热混合仪设为 65℃。
  • 对于每次免疫沉淀和 2% 样品输入对照，制备 150μl 1X ChIP 洗脱缓冲液（75 μl 2X ChIP Elution Buffer #7009 + 75 μl 水）。
  1. 向 2% 样品输入对照管中添加 150 μl 1X ChIP 洗脱缓冲液并置于室温下直至开始进行步骤 6。
  2. 向每份 IP 样品中添加 150 μl 1X ChIP 洗脱缓冲液。
  3. 轻轻涡旋混合（1,200 转/分钟）并在 65°C 下孵育 30 分钟以将染色质从抗体/Protein G Magnetic Beads 上洗脱下来。对于这个步骤，热混合仪效果最佳。或者，可以在室温下转动洗脱，但是可能不会完全洗脱。
  4. 将试管置于磁性分离架中使 Protein G Magnetic Beads 沉淀，然后等待 1 至 2 分钟直到溶液澄清。
  5. 小心地将洗脱下来的染色质上清液转移至新试管。
  6. 向所有试管（包括步骤 1 中的 2% 输入样品）中添加 6 μl 5M NaCl 和 2 μl Proteinase K #10012 解交联，并在 65 °C 下孵育 2 小时。这次孵育可以延长过夜。
  7. 立即进入第七部分。或者，样品可在 -20℃ 下贮存。然而，为了避免形成沉淀物，确保在添加 DNA Binding Buffer #10007 之前，将样品加热到室温（第七部分，步骤 1）。

VII. 使用离心柱纯化 DNA

在开始之前

  • 使用前向 DNA Wash Buffer #10008 中添加 24 ml 乙醇 (96-100%)。此操作仅需在第一次DNA纯化前进行。
  • 对于第五部分制备的每份 DNA 样品，取出一支 DNA 纯化收集管 #10010。
  1. 向每份 DNA 样品中添加 750 μl DNA Binding Buffer #10007 并短暂涡旋混合。
    • 对于每 1 体积样品，应当使用 5 倍体积的 DNA 结合缓冲液。
  2. 从在步骤 1 中制备的每份样品中取出 450 μl 并将其至收集管的 DNA 离心柱中。
  3. 于微量离心机中以 14,000 转/分钟离心 30 秒。
  4. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
  5. 从在步骤 1 中制备的每份样品中取出剩余的 450 μl 并将其转移至收集管的离心柱中。重复步骤 3 和 4。
  6. 向收集管的离心柱中添加 750 μl DNA Wash Buffer #10008。
  7. 于微量离心机中以 14,000 转/分钟离心 30 秒。
  8. 从收集管取出离心柱并丢弃液体。离心柱再放入收集管中。
  9. 于微量离心机中以 14,000 转/分钟离心 30 秒。
  10. 丢弃收集管和液体。保留离心柱。
  11. 向每个离心柱中添加 50 μl DNA Elution Buffer #10009 并将其置于洁净的 1.5 ml 微量离心管中。
  12. 于微量离心机中以 14,000 转/分钟离心 30 秒，以洗脱 DNA。
  13. 取出并丢弃 DNA 离心柱。洗脱物即纯化的 DNA。样品可在 -20℃ 下贮存。

八、用 PCR 定量 DNA

建议

  • 使用带滤嘴的移液器吸头，从而最大限度地减少污染风险。
  • 试剂盒中所含的对照引物专门用于人或小鼠 RPL30 基因（#7014 + #7015）并且可以用于标准 PCR 或实时荧光定量 PCR。如果使用者进行的是另一个物种的 ChIP，则建议使用者针对 DNA 设计适宜的特异性引物并确定最佳的 PCR 条件。
  • 建议使用热启动 Taq 聚合酶以最大限度降低非特异性 PCR 产物的风险。
  • PCR 引物选择至关重要。应当严格遵循以下标准设计引物：
引物长度： 24 个核苷酸
最佳 Tm： 60℃
最佳 GC： 50%
扩增子尺寸： 150 至 200 bp（标准 PCR）
80 至 160 bp（实时荧光定量 PCR）

标准 PCR 方法

  1. 根据待分析样品的数量，标记适宜数量的 0.2 ml PCR 管。这些样品应当包括 2% 样品输入对照、阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照 Normal Rabbit IgG 样品，和未加入 DNA 的试管以排除 DNA 污染。
  2. 向每支管中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
  3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物，配置时多配置两个样本的试剂以弥补分管时的体积损耗。向每支反应管中添加 18 μl 主混合物。
试剂 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl)
无核酸酶的 H2O 12.5 μl
10X PCR 缓冲液 2.0 μl
4mM dNTP 混合物 1.0 μl
5 μM RPL30 引物 2.0 μl
Taq DNA 聚合酶 0.5 μl
  1. 启动以下 PCR 反应程序：
a. 初始变性 95℃ 5 分钟
b. 变性 95℃ 30 秒
c. 复性 62℃ 30 秒
d. 延伸 72℃ 30 秒
e. 重复步骤 b-d，共循环 34 次。
f. 终末延伸 72℃ 5 分钟
  1. 从每支反应管中取出 10 μl PCR 产物，使其与 100 bp DNA 标准品同时进行 2% 琼脂糖凝胶或 10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳，以进行分析。人 RPL30 #7014 和小鼠 RPL30 #7015 的 PCR 产物预期大小分别是 161 bp 和159 bp。

实时定量 PCR 方法

  1. 标记适当数量、兼容待用 PCR 仪型号的 PCR 管或 PCR 平板。PCR 反应应当包括阳性对照组蛋白 H3 样品、阴性对照 Normal Rabbit IgG 样品、监控 DNA 污染的不含 DNA 模板的试管和 2% 输入对照组染色质 DNA 的连续稀释物（未稀释、1:5、1:25、1:125），以生成标准曲线并测定扩增效率。
  2. 向 PCR 平板上的每只管或每个孔中添加 2 μl 相应的 DNA 样品。
  3. 按下文所述的步骤制备主反应混合物。额外足量配置两个反应的试剂以弥补分管时的体积损失。向每支 PCR 反应管或每个孔中添加 18 μl 反应混合物。
试剂 1 次 PCR 反应所需体积 (18 μl)
无核酸酶的 H2O 6 μl
5 μM RPL30 引物 2 μl
SYBR-Green Reaction Mix 10 μl
  1. 启动以下 PCR 反应程序：
a. 初始变性 95℃ 3 分钟
b. 变性 95℃ 15 秒
c. 复性和延伸： 60℃ 60 秒
d. 重复步骤 b 和 c，共循环 40 次。

  1. 使用实时 PCR 仪的自带软件，分析定量 PCR 结果。或者，可以使用输入样品百分数方法和以下所示的公式，手动计算 IP 效率。采用这种方法，从每次免疫沉淀获得的信号表述为占总输入样品染色质的百分比。

    输入百分比 = 2% x 2（C[T] 2% 输入样品 – C[T] IP 样品）

    C[T] = CT = PCR 反应的阈周期

九、NG-Sequencing文库构建

用这种试剂盒制备的免疫富集的 DNA 样品可用于 ChIP-seq 。要构建下游 NG 测序用 DNA 文库，请使用与您的下游测序平台相容的 DNA 文库制备实验步骤或试剂盒。要在 Illumina® 平台上测序，我们推荐您使用 NEBNext® Ultra™ II Library Prep Kit for Illumina®（New England Biolabs；货号：E7645S/L）。

建议：

  • 对于转录因子或辅因子 ChIP-seq，使用至少 5 ng ChIP 富集的 DNA 和 10 个 PCR 循环扩增衔接子连接的 DNA。
  • 对于总组蛋白和组蛋白修饰或样品输入对照，开始时使用至少 50ng ChIP 富集的 DNA 和 6 个 PCR 循环扩增衔接子连接的 DNA。
  • 要对全部靶标类型的 ChIP-富集的 DNA 构建文库，需对衔接子连接的 DNA 进行纯化，但无需进行大小选择。
  • 在构建 DNA 文库之后，使用 Agilent High Sensitivity DNA Kit （Agilent Technologies，货号：G2938-90322）或通过与 50-100 ng DNA 在 2% 琼脂糖 TAE 凝胶上进行琼脂糖凝胶电泳，来检验 DNA 文库中衔接子二聚体（约 140 bp）是否存在。如果 DNA 文库中存在衔接子二聚体，则重复 PCR 扩增材料的纯化。
  • 也可通过对已知阳性和阴性靶基因座使用 qPCR 和引物组来确认文库的质量。与阴性引物相比，阳性引物对仍然应当产生相同的高信号，如原始 qPCR 分析 ChIP 富集的 DNA 时所见。
  • 完成最终的纯化和质量检验后，制备浓度为 2-10 nM 的最终纯化文库样品以用于高通量测序。

附录 A：预期的染色质产量

从组织样品收获交联的染色质时，组织类型之间的染色质产率可能显著不同。右表显示了用 25 mg 组织（类似于 4 x 106 个 Hela 细胞）制备的染色质预期产率和预期 DNA 浓度的范围，该产率和浓度按实验步骤第四部分的方法测定。对于每种组织类型，使用 Medimachine (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器离散获得了相似数量的染色质。但是，与用通过 Dounce 匀浆器离散的组织制备和处理的染色质相比，用通过 Medimachine 离散的组织制备和处理的染色质通常具有更高的 IP 效率。强烈推荐 Dounce 匀浆器用于离散脑组织，原因是 Medimachine 无法将脑组织充分分离成单细胞悬液。为了获得最佳的 ChIP 结果，我们建议每次免疫沉淀使用 5 至 10 μg 消化的交联染色质，因此，对于某些组织，每次免疫沉淀可能需要收获超过 25 mg。

组织/细胞 染色质总产率 预期 DNA 浓度
脾 20-30 μg/25 mg 组织 200-300 μg/ml
肝 10-15 μg/25 mg 组织 100-150 μg/ml
肾 8-10 μg/25 mg 组织 80-100 μg/ml
脑 2-5 μg/25 mg 组织 20-50 μg/ml
心脏 2-5 μg/25 mg 组织 20-50 μg/ml
Hela 10-15 μg/4 x 106 个细胞 100-150 μg/ml

附录 B：染色质消化的优化

将交联的染色质 DNA 消化成 150-900 个碱基对长度的最佳条件高度取决于 Micrococcal Nuclease 对消化中所用组织量或细胞数目的比率。以下是确定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的实验步骤。

  1. 如第一、二和三部分中所述，从125 mg 组织或 2 X 107 个细胞（等同于 5 份 IP 制备物）制备交联的胞核。在第三部分的步骤 2 之后停止，并如下所述继续。
  2. 将 100 μl 胞核制备物转移入 5 个独立的 1.5 ml 微量离心管中，然后置于冰上。
  3. 向 27 μl 1X 缓冲液 B + DTT（1:10 酶稀释度）中添加 3 μl Micrococcal Nuclease 原液。
  4. 向步骤 2 中 5 支离心管的每支试管中添加 0 μl、2.5 μl、5 μl、7.5 μl 或 10 μl 稀释的 Micrococcal Nuclease，翻转离心管数次进行混合，然后在 37°C 下孵育 20 分钟，同时频繁混合。
  5. 添加 10 μl 0.5 M EDTA 并将离心管置于冰上以终止消化。
  6. 置于微量离心机中，在 4℃ 下以 13,000 转/分钟离心 1 分钟，使胞核沉淀，并移除上清液。
  7. 将胞核沉淀物用 200 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 重悬。在冰上孵育 10 分钟。
  8. 用几个脉冲对裂解物进行声波处理以破坏胞核膜。脉冲间期，将样品置于湿冰上孵育 30 秒。可以通过在光学显微镜下观察声波处理前后的胞核，确定完全裂解胞核所需的最佳条件。通过使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探头的 VirTis Virsonic 100 Ultrasonic Homogenizer/Sonicator，Hela 胞核在 3 组 20 秒的脉冲之后完全裂解。或者，可以通过将裂解物置于 Dounce 匀浆器中搅匀 20 次，裂解胞核；但是，裂解可能不完全。
  9. 通过在微量离心机中在 4℃ 下以 10,000 转/分钟离心 10 分钟，使裂解物变得澄清。
  10. 从每份超声处理的裂解物中取出 50 μl 转移至新的微量离心管。
  11. 向每份 50 μl 的样品中添加 100 μl 无核酸酶水、6 μl 5 M NaCl 和 2 μl RNAse A。涡旋混合并在 37°C 下孵育 30 分钟。
  12. 向每份 RNAse A 消化的样品中添加 2 μl Proteinase K。涡旋混合并在 65°C 下将样品孵育 2 小时。
  13. 从每份样品取出 20 μl，使其与 100 bp DNA 标准品在 1% 琼脂糖凝胶上进行电泳以确定 DNA 片段大小。
  14. 观察哪个消化条件能够产生所需 150-900 碱基对（1 至 5 个核小体）范围内的 DNA。优化实验步骤中能够获得所需 DNA 片段大小的 Micrococcal Nuclease 的稀释体积等于需添加至一份免疫沉淀制备物（25 mg 离散的组织细胞或 4 X 106 个组织培养细胞）以获得所需 DNA 片段大小的 Micrococcal Nuclease 原液体积的 10 倍。例如，如果在此实验步骤中，5 μl 稀释的 Micrococcal Nuclease 产生 150-900 碱基对的 DNA 片段，则应当在第三部分中消化染色质期间向一份 IHC 制备物中添加0.5 μl Micrococcal Nuclease 原液。
  15. 如果结果表明 DNA 的大小未在所需的范围内，则重复优化实验步骤，每次消化中相应调节 Micrococcal Nuclease 的量。或者，可以改变消化时间以提高或降低 DNA 片段化的程度。

附录 C：故障排除指南

问题 可能的原因 建议
1. 消化的染色质浓度过低。 添加至染色质消化的细胞数不足，或者胞核在消化后未完全裂解。

如果染色质制备物的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml，则向每次 IP 中添加额外的染色质以确保每次 IP 至少产生 5 μg，然后继续实验。

在交联之前计算备用平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量，和/或在声波处理前后在显微镜下观察胞核，以证实胞核完全裂解。
2. 染色质消化不足且片段过大（大于 900 bp）。

细胞可能已经过度交联。交联超过 10 分钟可能会抑制染色质的消化。

向染色质消化中添加过多细胞或未添加足够的 Micrococcal Nuclease。

在甲醛浓度固定的情况下进行一段时间。将交联时间缩短至 10 分钟或更短。

在交联之前计算备用平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量；有关染色质消化的优化，参见附录 B。
3. 染色质过度消化并且片段过小（只有 150 bp 单核小体的长度）。在 PCR 定量期间，将染色质完全消化成单核小体长度的 DNA 可能削弱信号，尤其对于长度大于 150 bp 的扩增子更是如此。 添加至染色质消化的细胞不足或 Micrococcal Nuclease 过多。 在交联之前计算备用平板上细胞的数量，以确定准确的细胞数量；有关染色质消化的优化，参见附录 B。
4. 样品输入对照组 PCR 反应中无产物或产物很少。

添加至 PCR 反应的 DNA 不足或条件不是最佳。

PCR 扩增区域可能跨越无核小体的区域。

添加至 IP 反应的染色质不足或染色质过度消化。

向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。

使用来自交联并消化后的染色质的纯化 DNA，优化实验引物组的 PCR 条件。设计不同的引物组并将扩增子的长度减少到小于 150 碱基对（请参见第八部分中的引物设计建议）。

为获得最佳 ChIP 结果，每次 IP 添加 5-10 μg 染色质。参见上述问题 1 和 3 的建议。
5. 阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中无产物。

添加至 IP 反应的染色质或抗体不足，或者 IP 孵育时间过短。

蛋白 G 微珠中染色质洗脱不完全。

确保向每次 IP 反应中添加 5-10 μg 染色质和 10 μl 抗体并和抗体一起孵育过夜。在添加蛋白 G 微珠后需额外孵育 2 小时。

在 65℃ 下将染色质从蛋白 G 微珠洗脱为最佳，同时频繁混合以保持微珠悬浮在溶液中。
6. 阴性对照 Rabbit IgG-IP 和阳性对照 Histone H3-IP PCR 反应中产物的数量相等。

添加至 IP 反应的染色质过多或不足。或者，添加至 IP 反应的抗体过多。

添加至 PCR 反应的 DNA 过多或扩增循环次数过多。

向每次 IP 反应中添加不超过 15 μg 的染色质和 10 μl Histone H3 Antibody。每次 IP 将 Normal Rabbit IgG 缩减至1 µl/IP。

向 PCR 反应中添加更少的 DNA 或减少 PCR 循环次数。在 PCR 的线性扩增阶段范围内分析 PCR 产物极为重要。否则，不能准确测量起始 DNA 数量的差异。
7. 实验抗体 IP PCR 反应中无产物。

添加至 PCR 反应的 DNA 不足。

添加至 IP 反应的抗体不足。

抗体不适用于 IP。

向 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。

通常，需向 IP 反应中添加 1 至 5 µg 的抗体；但是，实际加入量很大程度上取决于各个抗体本身。

增加添加至 IP 反应的抗体量。寻找其他替代抗体。

发布​于 2011 年 12 月 

修订于 2016 年 10 月

实验步骤编号：1184

特异性/敏感性

Phospho-c-Jun (Ser73) (D47G9) XP® Rabbit mAb 仅当 Ser73 磷酸化后可检测内源水平的 c-Jun。该抗体也可识别 Ser100 位点被磷酸化的 JunD。

物种反应性：

人, 小鼠, 大鼠, 猴, 猪

基于 100% 序列同源性预测发生反应的物种：

牛

来源/纯化

使用与人 c-Jun 的 Ser73 周围残基相对应的合成磷酸肽，对动物进行免疫接种来产生单克隆抗体。

背景

c-Jun 蛋白是 Jun 家族成员，该家族还包括 c-Jun、JunB 和 JunD，并且c-Jun 蛋白也是转录激活因子蛋白 1（AP -1）的组成部分。AP-1 包括 Fos 和 Jun 以及 ATF 家族成员的二聚体，能够结合并激活 TRE/AP-1-分子的转录（在 1 中论述）。包括生长因子、趋化因子和压力在内的胞外信号可激活 AP-1 依赖性转录过程。C-Jun 的转录活性可通过 SAPK/JNK 对 Ser63 和 Ser73 的磷酸化进行调控（在 2​中论述）。小鼠基因敲除实验表明 c-Jun 对于胚胎形成至关重要 (3)，并且后续研究证明 c-Jun 在各种组织和发育过程中发挥作用，包括轴突再生 (4)、肝脏再生 (5) 和 T 细胞发育 (6)。AP-1 蛋白根据细胞类型和环境的不同，调节基因发挥各种生理功能包括细胞增殖、分化和凋亡，以及转化、侵袭和转移 (7-9)。其他靶基因能调节生存以及缺氧、血管生成 (8,10)。研究表明 c-Jun 可以作为癌症、血管重构、急性炎症反应和类风湿关节炎的重要治疗靶点 (11,12)。

  1. Jochum, W. et al. (2001) Oncogene 20, 2401-12.
  2. Davis, R.J. (2000) Cell 103, 239-52.
  3. Hilberg, F. et al. (1993) Nature 365, 179-81.
  4. Raivich, G. et al. (2004) Neuron 43, 57-67.
  5. Behrens, A. et al. (2002) EMBO J 21, 1782-90.
  6. Riera-Sans, L. and Behrens, A. (2007) J Immunol 178, 5690-700.
  7. Leppä, S. and Bohmann, D. (1999) Oncogene 18, 6158-62.
  8. Shaulian, E. and Karin, M. (2002) Nat Cell Biol 4, E131-6.
  9. Weiss, C. and Bohmann, D. (2004) Cell Cycle 3, 111-3.
  10. Karamouzis, M.V. et al. (2007) Mol Cancer Res 5, 109-20.
  11. Kim, S. and Iwao, H. (2003) J Pharmacol Sci 91, 177-81.
  12. Dass, C.R. and Choong, P.F. (2008) Pharmazie 63, 411-4.

通路和蛋白

探索与本品相关的通路 + 蛋白。

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