Product Brief

Instructions

工作原理

SABC 是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的。链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质，分子量60000。同亲和素一样，对生物素分子有极高的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍。等电点接近中性，这些特点使链霉亲和素的非特异吸附很低。因该方法的中心是StreptAvidin-Biotin-enzyme Complex，故命名为SABC。SABC 兼具高敏感性，低背景和操作简便的优点。SABC-Cy3 代表了新一代的免疫荧光方法。Cy3 比传统上的荧光更具有亲水性，因而不会因疏水性而引起非特异性吸附或聚合，从而背景更低。而且其敏感性和稳定性都更好。CY3 在 554nm 激化，在568-574nm 发射荧光，呈鲜红色。免疫组化双显色试剂盒采用CY3+过氧化物酶POD 标记的链酶亲和素（SABC-CY3+POD），用户根据实验需要，可在同一张切片上用两套显示系统观察。

使用说明

用户自备试剂：
1．粘片剂APES 或POLY-L-LYSINE（博士德公司有售）。
2．免疫组化专用PBS（pH7.2-7.6）配法：1000ml 蒸馏水中加氯化钠8.5g, Na2HPO4 2.8g,NaH2PO4 0.4g。如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
3．0.01M 枸橼酸盐缓冲液：1000ml 蒸馏水中加枸橼酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）3g, 枸橼酸(C6H8O7·H2O ) 0.4g。
4．DAB 显色试剂盒（博士德公司有售）。
免疫组化染色程序的选择：用户需根据抗原/抗体的特点确定程序，多数情况下要先比较各程序染色结果。
A 程序：石蜡切片热修复抗原程序。促进某些位于蛋白质内部的位点暴露。
B 程序：石蜡切片酶消化程序。促进某些被固定遮避的抗原位点暴露。
C 程序：石蜡切片不消化/不修复程序。适于稳定的抗原。
D 程序：细胞涂片，冰冻切片染色程序。
A.石蜡切片微波修复抗原染色程序:
1.载玻片防脱片剂处理:可选择APES 或Poly-Lysine。捞片后置烤箱58-60 ℃30-60 分以使切片紧密粘附。
2.切片脱蜡至水。
3.蒸馏水新鲜配置3%H2O2，室温10 分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗2 分钟×3 次。
4.微波修复抗原：将切片浸入0.01M,PH6.0 柠檬酸盐缓冲液中,电炉或微波炉加热至沸腾后断电，循环2-3 次。冷却后进行下一步。
5.滴加用0.02M PBS 1：10 稀释正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体, 不洗。
6.滴加适当稀释的一抗（兔IgG），20-37 ℃ 1~2 小时或4℃过夜。0.02MPBS 洗2 分钟×3 次。（一抗的稀释度、孵育时间、温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。）
7.配制二抗工作液：取1ml 0.02M PBS或TBS（PH7.2-7.6）加入生物素化山羊抗兔IgG 10μι, 混匀后加至切片。20-37℃20 分钟。0.02M PBS洗2 分钟×3 次。
8.配制SABC-CY3或（SABC-POD）工作液：取1ml 0.02M PBS 或TBS（PH7.2-7.6）加入试剂SABC-CY3或（SABC-POD）10μι,混匀后加至切片。20-37℃20 分钟。0.02M PBS 洗5 分钟×4 次。
9.DAB 显色:按100ml 0.02M PBS 或TBS 中加入最终浓度为25-50mgDAB,0.03%的H2O2。或使用DAB 显色试剂盒(AR1022)。取1ml 蒸馏水,加试剂盒中A,B,C 试剂各1 滴,混匀后加至切片。室温显色, 镜下控制反应时间，一般5-30 分钟。蒸馏水洗涤。
10.苏木素轻度复染。0.02M PBS 或TBS（PH7.2-7.6）洗，蒸馏水洗。水溶性封片剂封片(可用甘油代替)。
B. 石蜡切片酶消化程序:
以下面的步骤代替A 程序中的第4 步:滴加复合消化液(博士德有售)5-10 分钟。蒸馏水洗3 次。也可以使用0.1%的胰蛋白酶作消化液。
C. 石蜡切片不消化/不修复程序:
对于不需要微波修复或消化的抗原,省略A 程序中的第4 步即可。
D.血涂片，细胞和冰冻切片染色程序：
1.载玻片经防脱片剂处理（Poly-L-Lysine）。抗凝血经分层离心后涂片；培养细胞也可涂片或贴片生长；冰冻切片室温风扇吹干。
2.固定方案首选4%多聚甲醛或10%福尔马林固定30 分钟。
3. 30%H2O2 1 份+纯甲醇50 份混合,室温浸泡30 分钟，以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗1-2 次。其余步骤和石蜡切片5-10 步相同。
结果观察：
荧光显微镜下：有鲜红色颗粒者为阳性染色。
普通显微镜下：有棕黄色颗粒者为阳性染色。