Product Brief

Instructions

用户自备试剂：
1．粘片剂APES 或POLY-L-LYSINE（博士德公司有售）。
2．免疫组化专用PBS（pH7.2-7.6）配法：1000ml 蒸馏水中加氯化钠8.5g, Na2HPO4 2.8g,NaH2PO4 0.4g。如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
3．0.01M 枸橼酸盐缓冲液：1000ml 蒸馏水中加枸橼酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）3g, 枸橼酸(C6H8O7·H2O ) 0.4g。
4．DAB显色试剂盒（博士德公司有售）。
免疫组化染色程序的选择：用户需根据抗原/抗体的特点确定程序，多数情况下要先比较各程序染色结果。
A 程序：石蜡切片热修复抗原程序。促进某些位于蛋白质内部的位点暴露。
B 程序：石蜡切片酶消化程序。促进某些被固定遮避的抗原位点暴露。
C 程序：石蜡切片不消化/不修复程序。适于稳定的抗原。
D 程序：细胞涂片，冰冻切片染色程序。
A.石蜡切片微波修复抗原染色程序:
1．载玻片防脱片剂处理:可选择APES 或Poly-Lysine。捞片后置烤箱58-60 ℃30-60 分以使切片紧密粘附。
2．切片脱蜡至水。
3．蒸馏水新鲜配置3%H2O2,室温10 分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗2 分钟×3 次。
4．微波修复抗原:将切片浸入0.01M,PH6.0 柠檬酸盐缓冲液中, 电炉或微波炉加热至沸腾后断电，循环2-3 次。冷却后进行下一步。
5．滴加用0.02M PBS 1：10 稀释正常血清封闭液（二抗同种动物来源血清）,室温20 分钟。甩去多余液体, 不洗。
6．滴加适当稀释的一抗（大鼠或山羊，人IgG），20-37 ℃ 1~2 小时或4℃过夜。0.02MPBS 洗2 分钟×3 次。（一抗的稀释度、孵育时间、温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。）
7．配制二抗工作液：取1ml0.02M PBS 或TBS（PH7.2-7.6）加入生物素化兔抗山羊IgG(或兔抗大鼠IgG，或兔抗人IgG) 10μι, 混匀后加至切片。20-37℃20 分钟。0.02M PBS洗2 分钟×3 次。
8．配制SABC 工作液：取1ml0.02M PBS 或TBS（PH7.2-7.6）加入试剂SABC 10μι,混匀后加至切片。20-37℃20 分钟。0.02M PBS 洗5 分钟×4 次。
9．DAB 显色:按100ml 0.02M PBS 或TBS 中加入最终浓度为25-50mgDAB,0.03%的H2O2。或使用DAB 显色试剂盒(AR1022)。取1ml 蒸馏水,加试剂盒中A,B,C 试剂各1 滴,混匀后加至切片。室温显色, 镜下控制反应时间，一般5-30 分钟。蒸馏水洗涤。
10．苏木素轻度复染。脱水,透明,封片。观察。
B. 石蜡切片酶消化程序:
以下面的步骤代替A 程序中的第4 步:滴加复合消化液(博士德有售)5-10 分钟。蒸馏水洗3 次。也可以使用0.1%的胰蛋白酶作消化液。
C. 石蜡切片不消化/不修复程序:
对于不需要微波修复或消化的抗原,省略A 程序中的第4 步即可。
D.血涂片，细胞和冰冻切片染色程序：
1.载玻片经防脱片剂处理（Poly-L-Lysine）。抗凝血经分层离心后涂片；培养细胞也可涂片或贴片生长；冰冻切片室温风扇吹干。
2.固定方案首选4%多聚甲醛或10%福尔马林固定60-90 分钟。
3. 30%H2O2 1 份+纯甲醇50 份混合,室温浸泡30 分钟，以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗1-2 次。其余步骤和石蜡切片5-10 步相同。如果冰冻切片直接染色结果不理想时,可以参照石蜡切片对切片进行热修复，方法和石蜡切片4-10 步相同。
注意事项：
1. 如果染色背景过高，在SABC 反应之后，DAB 显色之前,用加有0.01—0.02% TWEEN20 的PBS（pH7.2-7.6）洗涤切片4 次，单纯PBS 洗2 次，然后DAB 显色。
2. 热修复抗原可选0.01M 枸橼酸盐缓冲液（PH6.0）；也可以使用PBS、TBS 等多种缓冲液。