Product Brief

Instructions

描述

所谓原位杂交是指借助于核酸分子杂交的方法，在显微镜水平检测和定位特异的核苷酸片段。现在原位杂交已成为在分子水平研究肿瘤和遗传性疾病的发生，发展和调控等根本性问题的有力工具，其作用是免疫组化所无法代替的。 博士德专门设计了敏感性加强型原位杂交检测试剂盒。具有敏感性特高，操作简便和结果准确的优点。该试剂盒分为两种，一种为过氧化物酶检测，一种为碱性磷酸酶检测系统。 用于mRNA的杂交。MK1030和MK1032仅适于地高辛高效标记的寡核苷酸探针，不推荐使用每个探针分子仅标记一个地高辛的寡核苷酸探针。
如果使用cDNA探针，应在杂交之前变性探针。

用户自备试剂

原位杂交专用盖玻片；POLY-L-LYSINE；DEPC；20%甘油缓冲液（3%柠檬酸,2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC， 0.5M PBS ）

操作程序

一．培养细胞和冰冻切片
准备工作：缓冲液的配备
3%柠檬酸——100ml蒸馏水中加柠檬酸（C6H8O7·H2O）3g,PH2.0左右。
2×SSC——1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠（C6H5O7Na3·2H2O，分子量294）8.8g。
0.5×SSC——300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC——270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油——20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
0.5 M PBS——1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4·12H2O 6g, NaH2PO4·2H2O 0.4g,PH7.2-7.6。
操作程序： 注意：最重要的是及时固定，并在固定液中加入0.1%的DEPC处理，以抑制RNA酶对mRNA的分解作用.
1．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2．细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为37℃和5%的CO2，所用培养基为Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3．培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS，含有1/1000 DEPC。室温固定20–30分钟。蒸馏水洗，干燥后可-20℃冰冻保存2周。
4．30%H2O2 1份+甲醇 50份混合，室温处理30分钟以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗涤3次。
5．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化5—120秒钟。有时也可以不消化。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6．预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱37-40℃2—4小时。吸取多余液体，不洗。
7．杂交：用杂交稀释液 稀释地高辛标记的寡核苷酸探针，浓度一般0.5-2μg/ml。按每张切片加20μι杂交液。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭掉后，盖在切片上。恒温箱37—40℃杂交过夜。
8．杂交后洗涤：去掉盖玻片，30—37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次；0.5×SSC洗涤15分钟×1次；0.2×SSC洗涤15分钟×1次。必要时可重复0.2×SSC洗涤1次。
9．滴加封闭液：37℃30分钟。甩去多余液体，不洗
10．滴加生物素化鼠抗地高辛： 37℃60或室温120分钟。0.5M PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
11．滴加SABC：37℃20分钟或室温30分钟。0.5M PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12．滴加生物素化过氧化物酶：37℃20分钟或室温30分钟。0.5M PBS洗5分钟×4次。
13．DAB显色：使用DAB显色试剂盒—1ml蒸馏水加显色剂Ａ，Ｂ，C各一滴，混匀，加至标本上。镜下控制显色，一般在30分钟内。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
14．必要时苏木素复染，充分水洗。
15．酒精脱水，二甲苯透明，封片。

二．石蜡切片
如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 MPBS，含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块，固定1小时即可，较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40分钟，一定不要超过1小时。
1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2． 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或APES。
3．石蜡切片经常规脱蜡至水。3%H2O2室温处理10分钟以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗涤2次。
4．暴露mRNA核酸片段：切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化3–30分钟（视标本厚薄、新旧自行调整）。充分的消化可以使mRNA得到暴露，从而增强杂交信号；但另一方面，过度的消化又使切片明显减薄乃至消失，从而失去杂交信号。由于用户的切片情况各不相同，这就需要用户比较不同的消化时间，例如10分钟，20分钟，30分钟，以找到最佳的消化时间。0.5M PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
其余步骤和冰冻切片6-15步相同。
结果观察：阳性细胞的胞浆着色呈棕黄色。
注意事项：如果有少量的细胞核着色属于正常情况；如果出现大量的细胞核着色，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。有其它明显的非特异性染色现象时，可以用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释，一般稀释2—5倍。