Product Brief

Instructions

重要产品信息：

好的免疫印迹结果需要优化实验条件，包括样品量，凝胶类型，转移方法，膜类型，封闭剂，洗涤缓冲液，一抗浓度，二抗浓度和孵育时间等。

1.为获得最佳效果，在孵育步骤中使用摇床。

2.不要使用叠氮化钠作为缓冲液的防腐剂，因为它会抑制HRP。

3.始终戴上手套或使用干净的塑料镊子。金属装置必须没有可见的生锈痕迹，这可能导致斑点和/或高背景。

4.工作液暴露在阳光下或任何其他强光下都可能损害工作液使用效果。

5.由于阻断剂与抗体的交叉反应性引起非特异性信号，所以实验测试对于确定每种蛋白质印迹系统的适当封闭剂是至关重要的。阻止缓冲区也会影响系统的灵敏度。

6.当使用抗生物素蛋白/生物素系统时，避免使用牛奶作为阻断剂，因为牛奶含有不同量的内源性生物素，导致高背景信号。

7.使用足够量的洗涤缓冲液，封闭缓冲液，抗体溶液和底物工作溶液来覆盖印迹并确保其永不变干。使用大的封闭和洗涤缓冲液体积可以使非特异性信号最小化。

8.将Tween-20洗涤剂（终浓度为0.05-0.1％）加入到封闭缓冲液和所有稀释的抗体溶液中，以减少非特异性信号。

需要材料：

NC膜或PVDF膜

X射线胶片或成像系统

摇床

洗涤缓冲液：含有0.05-0.1％吐温20的洗涤液，PBS：10mM磷酸钠，150mM NaCl，pH7.2

TBS：10mM Tris，150mM NaCl，pH7.4

特异性的一抗，用洗涤缓冲液或封闭缓冲液稀释

HRP标记的二抗，特异性针对一抗，用洗涤缓冲液或封闭缓冲液稀释

封闭液：洗涤缓冲液中1-5％（w / v）封闭剂（例如酪蛋白，BSA或脱脂奶粉）

注意：博士德的ECL底物与所有封闭缓冲液兼容

使用说明：

1.室温封闭膜60分钟，同时摇动。

2.去除封闭液并添加一抗。在室温振荡培养1小时或在2-8℃过夜振荡。

3.将膜悬浮于清洗缓冲液中摇动5分钟以上。更换清洗缓冲液至少4-6次。增加洗涤缓冲液体积，洗涤次数和洗涤持续时间可能有助于使背景信号最小化。

4.在室温下孵育二抗1小时，同时摇动。

5.重复步骤3，去除未结合的HRP结合物。

注意：与HRP结合物孵育后，膜必须彻底清洗。

6.通过混合等量的检测试剂A和B来制备底物工作溶液。每平方厘米膜使用0.1mL工作溶液。

7.在室温下用工作液孵育印迹膜1-2分钟。

8.将印迹膜放在透明的保鲜膜或保护膜中。使用吸收性的纸巾去除多余的液体，小心地将气泡压出。

9.将印迹膜放在X光胶片或成像系统上显色。底物孵育后的30分钟内，发光最强烈。

疑难解答：