Product Brief

Instructions

实验操作步骤：

1．蛋白质的样品制备：

a．细胞样品的制备：

1.胰酶消化后裂解：细胞培养至80%左右密度时，以含0.25%胰蛋白酶消化，低速离心，弃上清。细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入裂解液(根据细胞数量定)反复吹打。

2.皿上直接裂解： 细胞培养至80%左右密度时，细胞经预冷的PBS漂洗3次，加入裂解液(根据细胞数量定)，转移至离心管中，反复吹打。

b.组织样品的制备： 新鲜组织块迅速置于预冷的生理盐水中，漂洗数次，按组织净重：裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理）

c.蛋白变性：处理后的样品加入样品缓冲液混匀，样品置1000C的水浴箱加热3-5分钟，10000g离心10分钟，取上清液。（样品可立即使用也可以分装冻存，-20℃可稳定保持数月。）

2．SDS-PAGE电泳：

a.制胶:

1.按比例配制分离胶（丙烯酰胺母液：单体：双体=29：1），缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇，以阻止氧气进入凝胶溶液中，37℃恒温箱中静置60min。

2.同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多的氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，37℃恒温箱中静置60min以上以保证完全聚合。

b.加样：依次加入标准品和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。样品一般在1.0mm厚的胶 加样50-100ug/lane)。

c.电泳：  加样完毕，选择适当的电压进行电泳即可。一般采用恒压浓缩胶55V，分离胶75V，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。

3．转膜：

蛋白质经SDS-PAGE分离后，从凝胶中转移到固相支持物上，常用的支持物有：硝酸纤维膜即NC膜或PVDF膜。电泳结束后，取出凝胶，在转印缓冲液中漂洗数秒。蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，包括湿式电转印和干式电转印。

a干式电转印： 将转印槽阴极平放工作台上，并在上面加三张电转印液浸透的1mm厚的滤纸，将电转印液浸透0.45μm的N.C膜放在滤纸上，再将凝胶平放在N.C膜上，最后在凝胶上加盖三层电转印液浸透1mm厚的滤纸，电流根据凝胶面积按1-2 mA/cm2, 接通电源，经1-1.5小时电转印。                                                                              

b湿式电转印： 打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫，再各放三块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC膜、凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，按照(-) 夹板-海棉-滤纸-胶块-NC膜-滤纸-海绵-夹板 (+)装好,依次除尽每层间气泡，夹好电转印夹。 电泳槽加满预冷电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内，连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极,  4℃ 250-300mA, 转印80min（根据分子量不同，转印时间可适当调整）。

4．膜的封闭: 

TBS-T洗膜3次，每次10min, 以尽量洗去转印膜上的SDS (以免影响抗体的结合)，加入适量的封闭液，摇床摇动，室温封闭2h或4℃过夜。

封闭液配置：TBS溶液中加入5%的脱脂奶粉。

5．抗体杂交：

a封闭后的杂交膜放入杂交袋中，加入稀释的一抗，4℃孵育过夜或37℃两小时，TBS-T洗膜3次，每次10min。（一抗的稀释度，孵育时间，温度与显色强度，背景有直接关系。一般来说，阳性不强时可提高一抗浓度和延长孵育时间，而背景高，非特异性条带多，则降低抗体浓度和孵育时间）。

b加入稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG， 37℃孵育1.5小时或4℃过夜，TBS-T洗膜3次，每次10min。

一抗二抗稀释液配置：TBS溶液中加入5%的脱脂奶粉。

6．显色（ECM）

ECM显色剂配制:显色剂A和显色剂B按1：1的比例混合。将杂交后印迹膜放入显色盒中,加上适量的混合好的显色液反应约1-5分钟。吸去印迹膜边缘显色液,将一透明的玻璃纸盖住抚平,以确保X感光胶片的干燥。印迹膜转入暗室中使胶片曝光30秒-5分钟。将曝光后的X感光胶片放入显影液中至胶片上出现条带,再放入定影液中定影，胶片可长期保存。

荧光成像仪（CCD）检测：将印迹膜放置到荧光成像仪内，按仪器说明书进行检测和记录化学发光图像。

附录：

1:对照的设置  内参: 提示系统的稳定性,一般是一些管家蛋白; 阳性对照:即肯定可以表达目的蛋白的组织或者细胞,同时可以提示你一抗的质量; 阴性对照: 即肯定不会表达目的蛋白的组织或者细胞。