Product Brief

Instructions

需要而未提供的试剂和器材：
1． 转印了蛋白样品的NC 膜或PVDF 膜：通过SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质抗原，将PAG 胶上的蛋白质转印到硝酸纤维素膜（NC 膜）或PVDF 膜上。
2． 稀释缓冲液：使用中性稀释缓冲液即0.02 M PBS（AR0030）或0.02 M TBS（AR0144）配制封闭液和抗体稀释液。0.02 M PBS（pH7.2-7.6）：1000 ml 蒸馏水加Na2HPO4 2.8 g ，NaH2PO4 0.4 g，NaCl 8.5 g。如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。0.02M TBS (pH7.2-7.6)：1000ml 蒸馏水中加Tris 2.42g, NaCl 9g; 纯乙酸或浓盐酸调节pH 值(7.2-7.6)。
3． 洗涤缓冲液：每1000ml 中性稀释缓冲液中加入0.5 ml Tween20 即可。
4． 一抗：选择适合的一抗，用抗体稀释液稀释相应的一抗，一般特异性抗体工作浓度为1μg/ml, 具体的稀释度取决于特异性的一抗和膜上的抗原的量。
5． 摇床：膜的封闭、抗体孵育和洗涤都需平稳摇晃，需在摇床上操作。
6． 相机：记录结果。
操作程序：
1. 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样本和分子量标准。
2. 将蛋白样本转移至硝酸纤维素膜或PVDF 膜上。
3. 封闭硝酸纤维膜：用封闭蛋白干粉2 g, 加稀释缓冲液100 ml，20-37 ℃封闭1-2 小时。用量以浸没整张膜为准。
4. 用洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜5 分钟, 1 次。
5. 配制抗体稀释液：取90 ml 稀释缓冲液加1 g 封闭蛋白干粉和10 ml 浓缩抗体稀释液即可。一抗、二抗均用此稀释液稀释。
6. 硝酸纤维膜孵育一抗：用抗体稀释液稀释相应的一抗，一般特异性抗体浓度1μg/ml,20-37 ℃孵育2小时左右。如果缺乏特异性的条带或阳性不强，应提高一抗的浓度；如果有非特异性的条带，应提高一抗的稀释度。
7. 用洗涤缓冲液振荡洗涤硝酸纤维素膜3 次, 每次5 分钟。
8. 硝酸纤维膜孵育二抗：用抗体稀释液稀释相应的酶标二抗，效价1：200-400。37 ℃孵育一个半小时左右。用户可根据实际染色情况对稀释度做适当调整。
9. 用洗涤缓冲液振荡洗涤硝酸纤维膜4 次, 每次5 分钟。
10. DAB 显色:使用DAB 显色试剂。按每2 ml 蒸馏水加显色剂A，B，C 各１滴，混匀。混匀后加至膜上。室温显色。一般显色1－30 分钟。若无背景出现则可继续显色。显色后用蒸馏水洗涤以终止反应。
11. 观察，照相。
备注：可访问博士德网站获取详细的Western blotting 流程及全套产品信息。
注意事项：
1． 试剂频繁使用时置４℃，不常使用时置－２０℃。显色剂A 需置－２０℃冷冻保存。如有结晶析出，应确保结晶完全溶解再行使用。
2． 显色工作液应新鲜配制。