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产品编号：EK0101
规格：96T
检测范围：100ng/ml→1.56ng/ml
敏感性：＜10ng/ml
保存：2-8℃（频繁使用时）；-20℃（长时间不用时）。
有效期：6个月(4℃)；12个月（-20℃）。
用途：用于体外定量分析小鼠血清、血浆。
工作原理
博士德所提供的小鼠IgG ELISA Kit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒（Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay, ELISA）。预先包被的抗体为多克隆抗体。检测相抗体为多克隆抗体，经HRP标记。样品加入酶标板孔反应后，PBS或TBS洗涤。随后加入HRP标记抗小鼠IgG反应；经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的小鼠IgG呈正相关。
试剂盒中内容(96孔)
1． 小鼠IgG冻干标准品，1ug/管，总2管。
2． 预包被抗小鼠IgG抗体的96孔板。
3． 样品稀释液，30ml。
4． HRP标记抗小鼠IgG，130μl，效价1：100。
5． ABC稀释液，12ml。
6． TMB显色液，10ml。
7． TMB终止液，10ml。
8. 洗涤缓冲液(25X)，20ml。
9. 封板膜，4张。
需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪。
2. 自动洗板机。
3. 恒温箱
4. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器。
5. 干净的试管和Eppendof管。
6. 用去离子水将25X洗涤缓冲液稀释25倍，成1X洗涤缓冲液。
注意事项
1． 使用前TMB显色液应为无色透明溶液，若发现颜色异常，请及时与厂家联系。
2． 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
3 . 要严格避免操作过程中酶标板干燥。干燥会使酶标板上生物成份迅速失活。
4． 为免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和试管。
5． 禁止混用不同批次试剂盒内的试剂。
6. 本公司提供的96孔酶标板是单条可拆型酶标板，用户可按需求使用；剩余的酶标板请按保存条件贮存。揭封板膜和覆盖封板膜时应避免用力过大导致液体溅出。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的PBS或TBS洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
样品的准备和保存
样品如果不立即分析，应分装后冷冻保存，且避免反复冻融。
血清——用干净试管收集血液，凝固2小时后离心2000×g 20分钟，收集血清。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
血浆——采用肝素或EDTA抗凝，抽血后30分钟内离心2000×g 20分钟。立即分析或分装后-20℃冷冻保存。
样品稀释的一般原则
用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数，以使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量高、中、低的不同，分别采取不同的稀释方案：
高——指待测因子在1-10ug/ml。按1：100稀释。297μι样品稀释液加3μι样品。
中——指待测因子在100-1000ng/ml。按1：10稀释。225μι样品稀释液加25μι样品。
低——指待测因子在1.56-100ng/ml。按1：2稀释。120μι样品稀释液加120μι样品。
特低——指待测因子≤1.56ng/ml。样品一般不做稀释，或按1：2稀释。
以上方案仅供参考，样品的稀释应有详细记录。
试剂的准备和保存
A. 小鼠IgG标准品的稀释和使用：在使用前2小时内准备。
试剂盒提供2管标准品，每管1ug，每次使用1管。
1． 配制1ug/ml标准品：取1ml样品稀释液加入标准品管内，盖好后静置10分钟以上，然后反复颠倒/搓动以助溶解。
2． 配制100ng/ml标准品：取0.1ml 1000ng/ml的标准品加入有0.9ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀，做上标记。
3． 配制50ng/ml→1.56ng/ml标准品：准备6只Eppendorf管，每管加0.3ml样品稀释液，分别标记上50ng/ml, 25ng/ml，12.5ng/ml，6.25ng/ml，3.12ng/ml，1.56ng/ml。取0.3ml 100ng/ml的标准品加入标记50ng/ml的管中，混匀后同样取出0.3ml , 加入下一只管中。余同此类推，直到最后一只样品管。
注意：已经稀释的标准品（1ug/ml），应在12小时内使用。-20℃冷冻保存条件下，2天内可以使用,但不得反复冻融。
B．HRP标记抗小鼠IgG抗体工作液：在使用前2小时内准备。
1． 根据每孔需要0.1ml计算总的用量（实际配制时应多配制0.1-0.2ml）。
2． 按1μιHRP标记抗小鼠IgG加ABC稀释液99μι的比例配制工作液。轻轻混匀。
操作程序
已稀释好的HRP标记抗小鼠IgG和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。
1． 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放入冰箱中。
2． 将100ng/ml, 50ng/ml；25ng/ml , 12.5ng/ml ，6.25ng/ml，3.12ng/ml，1.56ng/ml的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于血清、血浆，每孔加100μι已用样品稀释液稀释的样品。
3． 酶标板加封板膜，37℃反应60分钟。
4． 1X洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。
5． 将准备好的HRP标记抗小鼠IgG工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白显色孔除外）。37℃反应30分钟。
6． 1X洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。
7． 按每孔依次加入90μι TMB显色液，37℃避光反应15-20 分钟
（注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显）。
8． 按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色。
9． 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
有两种设定空白对照的方案：
（1）将TMB空白显色孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去TMB空白显色孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。
（2）将零孔设为对照。所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
10．根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。
操作程序总结：
1． 加样品和标准品，37℃反应60分钟。0.01M TBS洗涤3次。
2． 加HRP标记抗小鼠IgG，37℃反应30分钟。0.01M TBS洗涤5次。
3． TMB37℃反应15-20分钟。
4． 加入TMB终止液，读数。
典型数据
TMB37℃反应15分钟。
（数据供参考，不同用户最佳显色时间会有所不同）
浓度 | 0.0ng/ml | 1.56ng/ml | 3.12ng/ml | 6.25ng/ml | 12.5ng/ml |
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