产品概况

试剂盒内容

未提供试剂：甲醇

实验操作指南

蛋白样品的制备

1. 样品的处理

取适当量的RIPA裂解液（见附表），放与4℃预冷，使用前数分钟内加入PMSF（见附表）和磷酸酶抑制剂（见附表）。

组织样本处理：

手术切除的组织块迅速置于预冷的PBS（见附表）中，漂洗数次，洗净组织血迹，用滤纸吸干组织表面液体，将组织切成几个较小的组织块。称量组织，按组织净重(g)：裂解液(ml)=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，匀浆器匀浆，肉眼观察无明显组织块，冰上孵育30分钟。10000g离心10分钟，取上清，即为蛋白提取物。

细胞样本处理：

贴壁细胞，细胞刮刮下细胞，计数，并收集5×10⁶ 个细胞，600g 离心5分钟，尽量吸尽上清，用预冷的PBS（见附表）重悬细胞，600g 离心5分钟收集细胞，尽量吸尽上清，加入0.5ml的预冷的裂解液，用移液器吹打数下，冰上孵育30分钟, 10000g离心10分钟，取上清，即为蛋白提取物。

悬浮细胞，计数，并收集5×10⁶ 个细胞，600g 离心5分钟，尽量吸尽上清，用预冷的PBS（见附表）重悬细胞，600g 离心5分钟收集细胞，尽量吸尽上清，加入0.5ml的预冷的裂解液，用移液器吹打数下，冰上孵育30分钟, 10000g离心10分钟，取上清，即为蛋白提取物。

注：裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA的复合物，可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验，超声条件：在100-120W的功率下，超声处理样本1min，冰浴条件下进行，超声2s，间隔2s。

2. BCA法测定蛋白浓度（参见附录中BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明）。

3. 用PBS调整蛋白浓度，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液（使用说明参见附录）。

注：待测样本建议总蛋白上样量为50μg，尽量保持单个待测样本上样体积为10μl。

电泳

1. 根据靶蛋白的分子量大小配制不同浓度的凝胶（凝胶配制见附录）。每个泳道加入待测样本和蛋白Marker（见附录），加入电泳缓缓冲液（见附录），开始电泳。

2. 80V恒压电泳，待溴酚蓝跑到凝胶分界处，改为恒压120V，跑完全程，电泳结束。

转膜

1. 根据靶蛋白的分子量选择不同孔径的PVDF膜（见附表），将PVDF膜置于甲醇中