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| Realtime PCR cDNA的合成 |  |
ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No. FSQ-301)是使用高效率逆转录酶「ReverTra Ace®」开发的Realtime PCR用的逆转录试剂盒。是含有逆转录反应必需的全部组分的5x浓度的完全预混型试剂，只要添加模板RNA与水，就能迅速地开始反应。另外添加了能强力分解DNA的gDNA Remover，在逆转录反应前对模板RNA进行处理，就可以简便地制备无基因组DNA的cDNA。最适用于待检测目的基因中存在假基因，或在跨越内含子位置不能设计引物，以及模板RNA中残存有基因组DNA污染等问题时的Realtime PCR实验。
●与Realtime PCR试剂的配合性良好
采用了对Realtime PCR反应体系影响最小的组分，即使在PCR中添加最多20%的逆转录反应液，也可以得到很高的直线相关性。最适用于表达量低的mRNA的高灵敏度检测。
●简便、迅速地去除基因组DNA
只要依次添加去除基因组DNA的试剂和逆转录反应试剂，约20分钟就可以制得不含基因组DNA的cDNA。
●完全预混型试剂
本品为放置于-20℃也不会冻结的完全预混型试剂。只要添加模板RNA和水，就可以简便高效率地合成cDNA，且重复性良好。
●容易配制逆转录反应的阴性对照
因为添附有相同的预混型no-RT对照，能够方便地配制逆转录反应的阴性对照。
●可得到更广的可定量扩增区域
将Oligo dT 与Random Primer按最适比例预混，可均一、高效地在RNA全序列范围内进行逆转录，因此可得到更广的可定量扩增区域。
1. gDNA Remover对基因组DNA去除效果的确认
为了确认gDNA Remover对基因组DNA的去除效果，按以下条件进行了逆转录反应，接着以β-Actin为目的基因进行Realtime PCR。结果显示，用gDNA Remover处理(+)、逆转录(-)<以下③>的条件时，没有扩增出现，可以确认基因组DNA已被去除掉。
●cDNA合成
试剂:ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover
模板:自己制备的HeLa total RNA 0.5μg /10μl反应体系
条件:使用gDNA Remover添加(+)、或无添加(-)的4x DN Master Mix，进行gDNA去除反应之后，分别用5x RT Master Mix II或5x RT Master Mix II no-RT Control进行逆转录反应。
●Realtime PCR
试剂:THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix (Code No.QPS-201)
模板:上述cDNA2μl/20μl反应体系(添加量10%)
Target:ACTB(188bp)
測定:Applied Biosystems 7900HT
2.与其他公司同类型产品基因组DNA去除能力的比较
在HeLa total RNA中添加过量的人基因组DNA，与其他公司同类型试剂盒进行基因组DNA去除能力的比较模拟实验。结果显示，ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover在基因组DNA去除方面效果更加明显。
●cDNA合成
试剂:ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(Code No.FSQ-301)及同类型其他公司的试剂盒2种
模板:HeLa total RNA(0, 1pg, 10pg, 100pg, 1ng, 10ng, 100ng, 1μg)+ 人 gDNA 100ng/20ul反应体系
条件:按各公司试剂盒的推荐条件进行
●Realtime PCR
试剂:THUNDERBIRD® SYBR® qPCR Mix(Code No.QPS-201)
模板:上述cDNA 2μl/20μl反应体系(添加量10%)
Target:ACTB(188bp)
测定:Applied Biosystems 7900HT
1)K.Miyazaki et al.,J.Bacteriology.,185:2219−2226(2003)
2)A.Nezu et al.,Biochem.J.,263:59−66(2002)
3)S.Nakashima et al.,J.Biochem.(Tokyo),131:241−246(2002)
4)S.Atsumi et al.,EMBO J.,20:5453−5460(2001)
5)Y.Yabuta et al.,Plant Cell Physiol.,41:666−675(2000)
6)S.Lee et al.,Gene,245:253−266(2000)
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