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Realtime PCR cDNA的合成
SuperPrep® Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Code: SCQ-101)是通过荧光定量PCR进行基因表达分析用的、由细胞裂解试剂(Lysis Reagents)和逆转录反应试剂(RT Reagents)组成的试剂盒。使用本产品，可以从用96孔板等培养的细胞开始，简便地制备含有能用作逆转录模板的RNA的细胞裂解物。而且，本试剂盒中含有的逆转录反应试剂，针对于从该细胞裂解物开始的逆转录反应进行了优化。使用本试剂盒，可以简便、迅速地从培养细胞开始合成荧光定量PCR用的模板cDNA，可用于高通量分析。
SuperPrep® Cell Lysis Kit for qPCR (Code: SCQ-201)是单独销售的细胞裂解试剂（Lysis Reagents）。可以使用本公司的RNA-directTM Realtime PCR Master Mix(Code No. QRT-101, QRT-201)等1-step法Realtime PCR试剂进行分析（简易测定）。
●无需纯化RNA
细胞用PBS(-)洗净后，向细胞中添加Lysis Solution (添加gDNA Remover)，悬浊，室温温育5分钟，即可同时进行细胞裂解和基因组DNA的分解。反应停止只要添加Stop Solution处理即可，无需热处理。
逆转录反应时，添加细胞裂解物（不要稀释），温育25分钟。
●从裂解物开始合成高品质的cDNA
通过优化的buffer组成，有效地抑制了因RNase等的细胞成分引起的RNA的降解，将cDNA合成中夹杂成分的影响降至最低（制备的RNA可在冰上稳定保持2小时）。另外，因为用DNase I处理后再进行cDNA的合成，所以可以合成基因组DNA污染少的高质量的cDNA。逆转录试剂是用本公司的高效率逆转录酶「ReverTra Ace®」进一步优化后的Master Mix，可简便、高效率地合成cDNA。合成的cDNA可长期保存。
本试剂可用于多种类型的细胞的分析。已经确认下表中的代表性细胞可适用于本品。
*Master Mix中Random 引物和Oligo dT引物按最适比例进行了混合。
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| 细胞名称 | 贴壁／悬浮 | 种类 | 细胞 | 来源 |
| 1 | A431 | 贴壁 | H.sapiens | epidermoid carcinoma cell line | 上皮样细胞癌 |
| 2 | C2C12 | 贴壁 | M. musculus | myoblast cell line | 肌细胞 |
| 3 | Caco-2 | 贴壁 | H.sapiens | colon adenocarcinoma cell line | 大肠癌 |
| 4 | CHO-K1 | 贴壁 | C. griseus | ovary cell line | 卵巢 |
| 5 | COLO205 | 悬浮 | H.sapiens | colon adenocarcinoma cell line | 大肠癌 |
| 6 | DLD-1 | 贴壁 | H.sapiens | colon adenocarcinoma cell line | 大肠癌 |
| 7 | HCT-15 | 贴壁 | H.sapiens | colon adenocarcinoma cell line | 大肠癌 |
| 8 | HDF | 贴壁 | H.sapiens | primary foreskin fibroblasts (primary cell) | 皮肤纤维芽细胞 |
| 9 | HEK293 | 贴壁 | H.sapiens | embryonic kidney cell line | 胎儿肾 |
| 10 | HeLa S3 | 贴壁 | H.sapiens | cervix carcinoma cell line | 子宫颈癌 |
| 11 | HepG2 | 贴壁 | H.sapiens | hepatocellular carcinoma cell line | 肝癌 |
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| 12 | Jurkat | 悬浮 | H.sapiens | T lymphocyte cell line | 白血病T细胞 |
| 13 | K562 | 悬浮 | H.sapiens | myelogenous leukemia cell line | 成红细胞样白血病细胞 |
| 14 | KUSA-A1 | 贴壁 | M. musculus | bone marrow stromal stem cell line | 成骨细胞样细胞系 |
| 15 | L929 | 贴壁 | M. musculus | aneuploid fibrosarcoma cell line | 结缔组织 |
| 16 | MCF7 | 贴壁 | H.sapiens | breast adenocarcinoma cell line | 乳腺癌 |
| 17 | Neuro2a | 贴壁 | M. musculus | neuroblastoma cell line | 神经细胞瘤 |
| 18 | NIH-3T3 | 贴壁 | M. musculus | embryo fibroblast cell line | 胎仔纤维芽细胞 |
| 19 | PC12 | 贴壁 | R. norvegicus | adrenal pheochromocytoma cell line | 肾上腺褐色细胞瘤 |
| 20 | rMSC | 贴壁 | R. norvegicus | bone marrow stromal stem cells (primary cell) | 骨髓间质细胞 |
| 21 | THP-1 | 悬浮 | H.sapiens | acute monocytic leukemia cell line | 单核细胞 |
| 22 | U937 | 悬浮 | H.sapiens | leukemic monocyte lymphoma cell line | 单核细胞 |
●降低了高通量分析时的误差
按照本操作步骤，移液分管及稀释操作步骤减少，降低了高通量分析时的误差。另外，细胞裂解时无需用移液枪头上下吹打混匀，而且同时可进行DNase I处理，提高了操作性。只要加入Stop Solution就可以终止DNase I的反应，无需引起RNA不稳定的加热操作。
●可以与各种荧光定量PCR试剂组合使用
可以与各种各样的荧光定量PCR试剂（SYBR® Green I, TaqMan® assay两种都可以）组合使用。
另外，与本公司的THUNDERBIRD® qPCR Mix (Code: QPS-101, QPS-201)等组合使用，已确认可以从培养细胞开始简便且高度准确的进行基因表达分析。而且，与本公司的RNA-direct™ Realtime PCR Master Mix (Code: QRT-101, QRT-201)等的1-step荧光定量PCR试剂组合使用， 可进行简易的分析。
1. 纯化RNA与细胞裂解物的Ct值相关性的检验
使用SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCR，从2.5×104个HEK293细胞开始合成cDNA(40ul反应体系)。另外，从HEK293细胞抽提的Total RNA 66.6ng开始，用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix(Code No. FSQ-201),进行cDNA的合成（40ul反应体系）。
之后，以分别的cDNA为模板，使用THUNDERBIRD SYBR qPCR (Code No. QPS-201),对15种管家基因进行荧光定量PCR，检验得到的Ct值的相关性。
结果表明，这次分析的15种基因，纯化RNA与使用细胞裂解物分析得到的结果具有良好的相关性。
2. 将数据的误差考虑在内的分析体系的质量评价
将HeLa S3细胞铺板于96孔板中，每孔加2×104个细胞，加100mM的PMA（phorbol 12-myristate 13-acetate）培养24小时。之后，用PBS(-)洗涤PMA处理过的12个孔、未处理的12个孔，用SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCR处理后进行cDNA的合成。以得到的cDNA为模板，使用THUNDERBIRD Probe qPCR Mix(Code No. QPS-101),对IL-6、IL-1β、β-actin基因进行TaqMan探针分析（n=12进行实验）。同样，使用A公司的对等产品进行荧光定量PCR（逆转录与荧光定量PCR试剂也是A公司试剂盒里附带的产品）。IL-6、IL-1β基因的Ct值用β-actin基因进行校正（△Ct）, 计算PMA处理前后的差（△△Ct）。
接着计算出Z’-factor并进行比较。
结果显示，两者的Z’-factor均超过了作为分析体系质量标准的0.5，但是使用SuperPrep Cell Lysis & RT Kit for qPCR、THUNDERBIRD Probe qPCR Mix(Code No. QPS-101)的实验中，与A公司的对等产品相比，显示出更高的Z’-factor，可见这是一种误差更少的良好的分析体系。
3. 对RNase活性强的细胞分析效率的验证
单细胞来源的细胞株U937的RNase活性相对较高，使用细胞裂解液分析困难。
本实验中，用分别从1×104，,1×103,1×102,1×10个U937细胞制备的细胞裂解物8ul，进行cDNA的合成（40ul反应体系），反应后，使用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix(Code No. QPS-201),对β-actin基因进行荧光定量PCR。
同样，使用A公司的同类品进行同样的分析（逆转录与荧光定量PCR试剂也是使用A公司试剂盒附带的产品）。
另外，使用从同样的样品纯化的相当量的Total RNA进行分析（使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix [Code No. FSQ-201],THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix [Code No. QPS-201]）。
结果显示，只有用本公司的产品分析，才能得到与使用纯化的RNA时相同的很高的线性相关性。
4.悬浮细胞的96孔板分析及基因表达分析的实验例
详细信息请参考这里（UPLOAD VOL. 102的链接）用pdf文件打开。
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