0
Realtime RT-PCR
| 本试剂盒是通过以高效率逆转录酶ReverTra Ace为逆转录酶和以Tth DNA Polymerase为PCR酶的两酶体系，进行一步法荧光定量PCR的试剂盒。主要使用TaqMan分析法进行荧光定量PCR。因为逆转录反应与PCR在同一反应体系中连续进行，反应液的分装操作一次就可以结束，适用于高通量分析。另外，样品间交叉污染的危险性也降低了。本产品中，两种酶与最优化过的buffer组分相组合，可以对微量RNA进行迅速定量。对RNA病毒及表达量低的mRNA的定量有利。另外，不易受目的基因序列的影响，可高灵敏度地检测出各种各样的RNA。 |  |
|
| |
● 迅速・高灵敏度
通过使用Probe的One-step qRT-PCR，可迅速且高灵敏度地对微量RNA进行定量。
● 序列偏差的降低
不易受目的基因序列的影响，可高灵敏度地检测出各种各样的RNA。
将多重检测（Multiplex）时各目的基因扩增的偏差降至最低。
●混杂物抗性的提高
可避免因血红素等的PCR抑制剂导致的灵敏度下降。
●使用dUTP
通过添加Uracil-N-Glycosylase(UNG)*，能够防止因Carryover污染而导致的假阳性发生。
* 本产品中不含有UNG。
| 原来的一步法的缺点 | 本试剂盒的改良点 |
| ●引物的优化比较困难 【高灵敏度比较困难】 ●容易产生因序列而导致的测定灵敏度偏差 | ●将因引物、探针或目的片段序列而引起的扩增偏差性影响抑制到了最小限度 →有利于各种各样的病毒及mRNA的迅速、高灵敏度检测或定量 |
| ●容易因RNA中的混杂物而引起灵敏度下降 | ●能够避免因混杂物引起的抑制 |
| ●用TaqMan probe法难于进行多荧光分析 | ●将多重检测中各目的片段扩增的偏差抑制到了最低限度 →最适于以管家基因作为对照的多数基因的相对定量等 |
1. 肠道病毒RNA的高灵敏度检测
将肠道病毒RNA作4倍稀释，使用TaqMan probe法，与其他公司的产品比较检测灵敏度及定量性。引物、TaqMan probe是直接使用论文记载的序列（没有进行优化处理）。用Applied Biosystems®、StepOnePlus™进行分析。
2. 各种病毒检测灵敏度的比较
制备11种病毒RNA的4倍稀释系列溶液，使用TaqMan probe法，进行最高检测灵敏度的比较。引物、TaqMan probe是直接使用论文记载的序列。用Applied Biosystems®、StepOnePlus™进行分析。
将各试剂能检测到的最低拷贝数连线作图。
结果显示：只有用本试剂盒时，才能对所有的目的基因以30个拷贝以下的灵敏度进行检测及定量。通过这个实验表明，本试剂不受目的片段序列的影响，能以高灵敏度检测到各种各样的RNA。
3. 多重荧光检测（Multiplex）体系中的表达定量
使用三种荧光标记的TaqMan探针，分别用单独检测及一次使用三种TaqMan探针的多重荧光检测体系，分析IL-1β、TNF-α、GAPDH基因的表达量。
实验中以HeLa S3 RNA（1pg~100ng的10倍稀释【6个梯度】）为样品，用Roche Diagnositics公司的LightCycler 96进行分析。
结果显示，各基因用单独（图1）及使用三通道的多重荧光检测（图2）分析中得到了相同的灵敏度，PCR效率及相关系数并没有太大的差异（表1）。
4. 使用临床检测样本的RS病毒A型、B型的同时定量
使用从20个检测体的咽喉粘液中提取的RNA样品，用RT-PCR法及使用THUNDERBIRD One-step qRT-PCR试剂盒的qRT-PCR，进行RS病毒的检测。
另外，同时与用抗体检测方法进行分析的结果进行比较。
为了判断RS病毒的A型和B型，使用特异的引物及各种不同荧光标记的TaqMan探针，用qRT-PCR进行定量分析。
用Roche Diagnositics公司的LightCycler 96进行分析。结果显示，抗体检测法中判定为假阴性的检测体，用PCR法可以高相关性地判定有无感染。另外，类型判定结果也完全一致。
使用各种不同的方法对RS病毒的检测相关试验结果
| 检测体编号 | 抗体检测方法 | PCR（定性、类型判定） | qPCR分析的定量值（拷贝数） | |
| A型检测（FAM, 470nm） | B型检测 （Cy5, 645nm） | |||
| 1 | + | +（A） | 1.6×105 | - |
| 2 | - | - | - | - |
| 3 | + | +（A） | 8.1×104 | - |
| 4 | + | +（A） | 2.7×105 | - |
| 5 | - | +（A） | 9.6×102 | - |
| 6 | - | +（A） | 3.6×103 | - |
| 7 | + | +（A） | 2.3×106 | - |
| 8 | - | - | - | - |
| 9 | + | +（A） | 1.5×105 | - |
| 10 | + | +（A） | 6.7×105 | - |
| 11 | - | - | - | - |
| 12 | + | +（A） | 1.6×105 | - |
| 13 | + | +（A） | 9.4×103 | - |
| 14 | - | +（A） | 9.5×103 | - |
| 15 | + | +（A） | 3.9×105 | - |
| 16 | + | +（A） | 2.4×105 | - |
| 17 | - | - | - | - |
| 18 | - | +（A） | 4.2×104 | - |
| 19 | - | +（A） | 3.4×102 | - |
| 20 | - | +（A） | - | 9.6×103 |
温馨提示:因厂家更改产品包装、产地或者更换随机附件等没有任何提前通知，且每位咨询者购买情况、提问时间等不同，为此以下回复仅对提问者3天内有效，其他网友仅供参考！若由此给您带来不便请多多谅解，谢谢！
服务热线
0771-3293894
新浪微博
腾讯微博
QQ空间
客服
