Pfu DNA Polymerase简称Pfu酶,是最常用的高保真DNA聚合酶之一。
Pfu DNA Polymerase是一种来源于嗜热菌Pyrococcus furiosus的高度热稳定的DNA聚合酶。Pfu酶的分子量为90kDa。Pfu酶可以催化5’至3’方向的依赖于DNA模板的脱氧核苷酸的聚合。和Taq酶不同,Pfu酶有3’至5’的外切酶活性(proofreading activity)。另外,Pfu酶有5’至3’外切酶活性,但Pfu酶没有反转录酶活性。
由于Pfu酶有3’至5’的外切酶活性,因此在PCR扩增过程中出错的几率大大降低,出错率为2.6×10-6 per nt per cycle。
Pfu的出错率不仅远远低于Taq酶,也低于一些其它的高保真DNA聚合酶例如Vent、DeepVent、Pwo、Tli等,因此Pfu酶常作为首选的高性价比的高保真DNA聚合酶。
来源:本Pfu DNA Polymerase为recombinant Pfu DNA Polymerase,通过大肠杆菌表达纯化获得,和纯化获得的天然Pfu DNA Polymerase在各方面的性质相同。
用途:高保真PCR (high fidelity PCR)、点突变、双平端PCR克隆等。
Pfu酶扩增出来的DNA片段为双平端,可以用于双平端克隆,但不能用于常规的T载体克隆。
dUTP和dITP或含有dUTP和dITP的引物不能用于Pfu酶介导的PCR扩增反应。
活性定义:One unit of the enzyme catalyzes the incorporation of 10 nmol of deoxyribonucleotides into a
polynucleotide fraction (adsorbed on DE-81) in 30 min at 72℃. Enzyme activity is assayed in the following mixture: 20 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 2 mM MgSO4, 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 0.1% (v/v) Triton X-100, 0.1 mg/ml BSA, 0.75 mM activated calf thymus DNA, 0.2 mM of each dNTP, 0.4 MBq/ml [3H]-dTTP.
纯度:不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶,不含RNA酶,满足常规PCR反应要求。
酶储存溶液:20 mM Tris-HCl (pH 8.2), 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 100 mM KCl, 0.1% (v/v) Nonidet P40, 0.1% (v/v)
Tween 20 and 50% (v/v) glycerol。
10X Pfu Buffer (with Mg2+):200 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25℃), 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 100 mM KCl, 1% (v/v) Triton X-100, 1 mg/ml BSA。
失活或抑制:酚氯仿抽提可以使Pfu酶失活。
包装清单:
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
D7217-1 | Pfu DNA Polymerase (5U/μl) | 1000U |
D7217-2 | 10X Pfu Buffer (with Mg2+) | 1ml×5 |
— | 说明书 | 1份 |
保存条件:
-20℃保存。
注意事项:
由于PCR反应非常灵敏可以扩增目的基因序列超过1000万倍,在使用Pfu酶时请注意避免微量待扩增DNA的污染,并尽量考虑设置不加模板的空白对照以确认是否有待扩增DNA的污染。
Pfu DNA polymerase在扩增DNA片段时的出错率非常低,但其扩增效率也比较低。对于出错率要求不高的情况,例如RT-PCR进行定量或半定量,推荐使用Taq DNA polymerase。在扩增效率和出错率需要兼顾的情况,可以选择BeyoTaq DNA polymerase。在扩增2kb以下DNA片段时,Pfu酶和Taq酶的扩增效率相近。在准确性要求很高的情况下,须选择Pfu酶。
Pfu酶有3’至5’的外切酶活性,在没有dNTP的情况下可以降解引物。因此Pfu酶一定要最后加入,并且要在冰浴上操作。
不能使用Taq酶的PCR Buffer来替代Pfu酶的PCR Buffer。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
试剂 | 最终浓度 | 体积 |
双蒸水或Milli-Q水 | - | (36.75-x)μl |
10X Pfu Buffer (with Mg2+) | 1X | 5μl |
dNTP (2.5mM each) | 0.2mM each | 4μl |
模板DNA | 10pg-1μg* | xμl |
引物混合物(10μM each) | 0.8μM | 4μl |
Pfu DNA Polymerase (5U/μl) | 1.25U/50μl | 0.25μl |
总体积 | - | 50μl |
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