2-8℃避光储存12个月。

（一）细胞复苏

1.取出冻存管，迅速在37℃水浴锅里融化，整个过程最好控制在1分钟以内。

2. 轻轻地混匀细胞并全部移到50ml的离心管中，逐滴加入 5-8ml在37℃水浴锅里预热的新鲜培养基。100g，5min离心细胞。

3. 倒掉上清，用10-20mL在37℃水浴锅里预热好的新鲜培养基重悬细胞，放到100mL培养瓶中。然后将细胞放到37℃，5%的CO₂恒温摇床中，110-175rpm培养。

4. 2-5天后取样计数细胞密度和活率，如果细胞密度达到1.0X10⁶cells/ml，则24进行正常传代培养；如果细胞密度低于1.0X10⁶cells/m，则收集细胞进行离心处理，100g，5min。然后重悬到20-30ml已经在37℃水浴锅里孵育好的新鲜培养基，继续培养。

5. 细胞生长正常后，传代时起始密度控制在0.3X10⁶cells/ml ，3-4天传一次代。

注意事项：冻存管融化速度越快越好；由于刚复苏的细胞比较脆弱，所以整个过程要轻以免损伤细胞。

（二）细胞传代

1. 取样计数细胞，计算细胞密度。

2. 按照起始细胞密度0.3-0.4X10⁶cells/ml，计算所需细胞悬液和培养基的用量传代，100ml的培养瓶中放15-20ml培养（或250ml的培养瓶放50-60ml培养）。37℃恒温培养箱中培养，5%CO₂，摇床转速：110-175rpm。

3. 每3-4天传一次代，起始细胞密度传到0.2-0.3X10⁶cells/ml。

如何使 CHO稳定株细胞适应SMM CHO-SI培养基：

通常情况下，细胞不经过驯化而能直接适应SMM CHO-GSI培养基，下面我们推荐2种方式来更换培养基：1）直接更换；2）逐步更换。首先选用的细胞要在对数生长期，同时细胞活率大于90%。

（三）直接更换

1. 细胞培养在加5-10%血清传统的培养基或其他无血清培养基里，直接稀释传代到SMM CHO-GSI培养基，细胞密度控制在0.3-0.4X10⁶cells/ml。

2.然后放入5%CO₂、37℃的恒温培养箱中，110-175rpm转速条件下培养。
3. 3-5天后进行传代或者换液

4. 继续传代培养，起始细胞密度控制在0.3-0.4X10⁶cells/ml，直到完全适应SMM CHO-GSI培养基。

5. 经过几代在100%的 SMM CHO-GSI培养基中培养，传代后4-6天细胞的密度可以达到2-3X10⁶cells/ml，细胞活率大于90%。这时说明细胞已经完全适应SMM CHO-GSI培养基。 注意: 如果直接更换没有成功，则进行逐步更换的方法养基。

注意: 如果直接更换没有成功，则进行逐步更换的方法

（四）逐步更换

1.细胞培养在加5-10%血清传统的培养基或其他无血清培养基里，稀释传代，细胞密度控制在0.3-0.4X10⁶cells/ml，原培养基与SMM CHO-GSI培养基的比例为75:25。

2.然后放入5%CO₂、37℃的恒温培养箱中，110-175rpm。

3. 3-5天后进行传代，如果细胞生长正常，则传代时原培养基与SMM CHO-GSI培养基的比例为50:50. 细胞密度仍控制在0.3-0.4X10⁶cells/ml。

4. 重复步骤3逐步增加SMM CHO-GSI培养基的比例（原培养基与SMM CHO-GSI培养基的比例为25:75；10:90）直到100%的SMM CHO-GSI培养基。

5.在100%的SMM CHO-GSI培养基中，传代后4-6天细胞的密度可以达到2-3X10⁶cells/ml，细胞活率大于90%。这时说明细胞已经完全适应SMM CHO-GSI培养基。

（五）冻存细胞

冻存细胞时CHO cells 要处在对数生长期同时细胞活率在90%以上。

1.取样计数细胞，根据冻存管数计算所用细胞悬液体积和冻存液的体积，比例如下：92.5%的培养基混合物（50% 的新鲜SMM CHO-GSI培养基+50% 条件SMM CHO-GSI培养基 ）+ 7.5% DMSO，最终的细胞数为 5 x 10⁶cells/ 管。

2.准备相应体积的冻存培养基：46.25% 的新鲜SMM CHO-GSI培养基 + 7.5% DMSO，放在4°C 备用。冻存培养基最好为当天配制。

3.通过100g，5-10min离心收集细胞，留46.25%条件培养基重悬细胞，然后逐滴加入事先准备好的放4°C 的冻存培养基。

4.混合均匀后分装细胞到冻存管中，一般2ml的冻存管放1-1.5ml，贴好标签。

5.然后放到冻存盒中，放入-80°C 冰箱(每分钟下降1°C)。

6.80℃冰箱中过夜放置（至少放置24小时），转移细胞到液氮罐中，推荐储存条件在-125°C to -200°C。