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Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit 50rxn

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号:A211-01

牌:Vazyme 诺唯赞

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检测早期凋亡

Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit

 

 

• 绿色荧光标记,可选择FITC或EGFP

• 试剂盒中含有PI,可与Annexin V配合区分凋亡/坏死细胞

• 适用于流式细胞仪和荧光显微镜

  

 

 

 

图1. 本产品能准确区分正常细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞,并能对凋亡的细胞精准定量,特异性高。

 

图A-E分别用0,0.5,1.5,4.5,13.5 ng/ml的TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) 处理Jurkat细胞3小时。(F) 13.5 ng/ml TRAIL诱导Jurkat细胞凋亡3小时后,加入10μg未标记的Annexin V封闭10分钟,再用Annexin V-FITC/PI染色。未标记的Annexin V可以竞争Annexin V-FITC,证明了染色的特异性。

 

 

 

 

 

      在正常细胞中,磷脂酰丝氨酸 (PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的磷脂酰丝氨酸 (PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36 kD 的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸具有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的细胞膜结合。因此Annexin V被公认为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行绿色荧光(FITC或EGFP)标记,以标记了的Annexin V作为探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

 

 
常见问题及解决方案
Q-1:Annexin V-FITC染色不上或者阳性率偏低。
A-1:首先要确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡。可通过设定确切凋亡诱导效果的阳性药物对照来排除这一情况。Annexin V-FITC染色不上,实验操作中最常见的原因是贴壁细胞消化不当引起的。Annexin V跟PS的结合需要Ca2+离子,Binding Buffer中含有2.5 mM的Ca2+,EDTA的消化会影响染色,建议使用无EDTA的胰酶。细胞离心用冷PBS洗涤后,应尽量吸干残余液体,残余过多的PBS中含有磷酸根,会形成磷酸钙沉淀。Binding Buffer的瓶盖要紧闭,空气中的CO2进入后形成CaCO3会产生沉淀,减少游离的Ca2+,导致实验的失败,污染其他的缓冲液如吸取PBS后不更换Tip头也会导致游离的Ca2+的减少。一些细胞其细胞膜上PS的密度较低,染色效果很差,此时建议更换细胞株或者采用TUNEL法检测凋亡。如果是贴壁细胞,药物诱导后漂浮的细胞要收集,这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞,丢弃会造成阳性结果偏低。
 
Q-2:假阳性。
A-2:实验中发现未经诱导凋亡的对照细胞经染色后AnnexinV+/PI+双阳性的细胞比例过高,造成这种结果的原因可能是细胞本身活力差。建议用台盼蓝染色计算细胞的活力,台盼蓝拒染的细胞应大于95%。若活力低,建议重新复苏细胞,通常刚复苏的细胞至少要传代3次以后才能进行实验;另一可能是细胞操作不当引起,尤其是贴壁细胞消化过程中反复剧烈吹打导致破坏细胞膜,使得假阳性偏高。此外,一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡,因此通常不需要处理大于48小时以上;诱导时间过长会使营养物质耗尽,导致细胞状态差,假阳性结果偏高。

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