产品组分

贮藏与保质期： 本产品应置于-20℃储存。保质期为一年。

常见问题及解决方案

Q-1：质粒各段无法正常扩增

A-1：a).引物设计有误：核对引物设计方案。

b).扩增体系配制错误：重复实验。

c).扩增反应条件不优化：调整Mg²⁺浓度、酶量、扩增程序。

d).模板质粒质量偏差：长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的质粒作为模板。

Q-2：平板上长不出克隆或克隆数目很少

A-2：a).感受态效率低：使用新制备或妥善冻存的感受态细胞，确保转化效率>10⁷cfu/μg。每次可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。

b).重组反应体系中DNA量不足，或者比例不佳：尽量按照推荐DNA的量配制反应体系。请务必预先检测DpnI消化产物的浓度。常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响，测定值和DNA实际浓度往往偏差非常大。因此，我们强烈推荐您通过琼脂糖电泳来测定样品中的DNA浓度。

c).重组环化反应体系中DNA不纯，抑制反应：未纯化DpnI消化产物加入重组反应体系内的总体积不应超过4 μl (反应体系体积1/5)。尝试对DpnI消化产物进行胶回收纯化。重组反应体系中应尽量避免金属络合剂 (如EDTA)的带入。因此，我们推荐您将DNA纯化产物溶解在pH8.0的ddH₂O中保存(常规胶回收试剂盒中的洗脱液可用pH8.0的ddH₂O替代)，请勿使用TE进行DNA保存。

d).感受态细胞中加入了过多的反应产物：反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。

e).出现转化抑制效应：当转化的DNA浓度太高时，会抑制转化反应。将重组反应产物稀释5倍后取1/5进行转化。

Q-3：定点突变未正确完成

A-3：a).引物设计错误：核对引物设计方案。

b).扩增反应所用模板为非甲基化的质粒：DpnI只能识别甲基化DNA，请务必使用从甲基化酶无缺陷的宿主菌中扩增的质粒作为PCR模板。

c).扩增反应使用过多的模板质粒：对于大多数质粒，1 ng模板量已足以使扩增反应正常进行，过多的质粒模板将会导致DpnI消化不完全，降低突变成功率。

Q-4：非目标位点突变

A-4：a).模板质粒携带未知位点突变：测序确认模板质粒序列正确性。

b).扩增循环数过多：为了防止扩增过程中引入非目标突变，扩增循环数不宜超过35。如果扩增效率良好的话，推荐扩增循环数应不超过30。

特别提醒!

在选择引物反向互补区时，应避免选择有重复序列的区域。当这一区域内GC含量在40%～60%范围之内时，重组环化效率将达到最大。如这部分区域GC含量高于70%或者低于30%，重组环化效率会受到较大影响。