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HiScript® II U+ One Step qRT-PCR Probe Kit
包含dUTP/UDG防污染系统的探针一步法qRT-PCR
• 热不稳定(Heat-labile)的UDG酶室温下迅速降解含U的双链DNA污染物
• 热不稳定(Heat-labile)的UDG酶在55℃迅速彻底失活，维持cDNA的完整性
• 可检测到个位数拷贝的模板或0.1 pg总RNA
• 支持多重探针检测
图1.HiScript® II U+ One Step qRT-PCR Probe Kit (Q223)提供良好的检测灵敏度和线性关系。
以Hela细胞总RNA为模板，用HiScript® II U+ One Step qRT-PCR Probe Kit (Q223) 扩增RFLPO 基因。由图可见，优化的dUTP浓度以及Heat-labile UDG使得扩增效率和灵敏度不会受到影响。相比之下，E.coli来源的UDG会严重影响one step RT-qPCR的检测灵敏度。
图2.dUTP/UDG防污系统原理示意图
dUTP/UDG防污染系统是一种非常有效的控制PCR扩增产物污染的手段。在以DNA为模板的PCR检测试剂中，已逐渐成为了一种强制标准。不过，常用的E. coli UDG在通常的逆转录温度 (42-55℃) 下仍具有较高的活性，会降解cDNA，导致One Step RT-PCR/qPCR的灵敏度降低。HiScript® II U+ One Step qRT-PCR Probe Kit含有比例优化的dUTP/dNTP mix，并加入了来源于嗜冷海洋细菌的Heat-labile UDG。Heat-labile UDG在室温下具有很高的活性，在反应体系混合过程中即可充分降解含U的双链DNA污染物。当反应体系升温至50-55℃ (HiScript® II的最适反应温度) 时，Heat-labileUDG迅速彻底失活，维持cDNA的完整性，保证检测灵敏度不受影响。
组分说明：
| 组分 | Q223-01 250 rxn (20 μl/rxn) |
| RNase free ddH2O | 2×1.25 ml |
| 2×One Step U+ Mixa | 2×1.25 ml |
| One Step U+ Enzyme Mixb | 250 μl |
| 50×ROX Reference Dye 1c | 100 μl |
| 50×ROX Reference Dye 2c | 100 μl |
a. 包含dNTP Mix, Mg2+ ，缓冲液
b. 包含HiScript® II Reverse Transcriptase、RNase inhibitor、UDG以及Champagne TaqTM DNA Polymerase
c. 用以校正孔与孔之间产品的荧光信号误差。使用ABI 7900HT/7300 Real-Time PCR System和StepOne PlusTM时使用50×ROX Reference Dye 1；ABI 7500,7500 Fast Real-Time PCR System, Stratagene Mx3000P使用50×ROX Reference Dye 2；Roche, Bio-Rad的Real-Time PCR仪不必使用ROX。
质量控制
所有组分经检测均无核酸外切酶、核酸内切酶及RNase残留。
功能测试：以HeLa细胞总RNA为模板，1 pg-1 μg起始量的6个浓度梯度，扩增B2M基因。扩增效率在0.95-1.05之间，且模板量为1 pg时CT值在35以内。
1. One Step U+ Enzyme Mix 含有高浓度的甘油，使用前请短暂离心，收集到反应管底部，并用移液枪轻轻吸打，充分混匀后准确吸取。
2. 反应液的配制请使用RNase-free 枪头，EP 管等，尽量避免污染。
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