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HiScript® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit
具有极高性价比的cDNA一链合成试剂盒
图1. R211可完整逆转录长达20kb的RNA模板
以1 μg HeLa细胞总RNA或小鼠骨骼肌细胞总RNA (for Nebulin)为模板,Oligo(dT)23VN为引物进行逆转录。取1 μl cDNA为模板，用Vazyme LAmp® DNA Polymerase扩增。
M:DL 15000 Marker.
图2.R211对qPCR具有宽广且灵敏的线性逆转录范围
以1 μg-1 pg HeLa细胞总RNA为模板做逆转录， 使用Random hexamers 和Oligo(dT)23VN共同逆转录，取1 μl cDNA为模板，分别用AceQ® qPCR SYBR® Green Master Mix扩增ACTB基因和CBR3基因。
图3. R211针对含有复杂结构的RNA模板具有更高的逆转录效率。
以1 μg HeLa细胞总RNA为模板，分别用R211和T品牌逆转录酶进行逆转录反应，时间设置为5 min。取1 μl cDNA为模板，用Vazyme LAmp® DNA Polymerase扩增含有高GC区域的FIB 6100 bp和Pole7117 bp片段。
本产品是基于高效的HiScript® II Reverse Transcriptase从总RNA或Poly (A)+ mRNA合成一链cDNA的试剂盒。含有一链cDNA合成所需的全部试剂。与HiScript® Reverse Transcriptase相比，HiScript® II Reverse Transcriptase具有更高的cDNA合成效率及模板的杂质耐受度，更加适合具有复杂二级结构或低丰度的RNA模板的逆转录。Anchored Oligo (dT)23VN设计结合位点锚定，特异性高，保证第一链cDNA合成效率和成功率。
合成的一链cDNA可广泛应用于二链cDNA合成、杂交、PCR法扩增等。特别适用于全长cDNA文库制作、高纯度全长cDNA合成等。若利用Oligo (dT)23VN从PolyA开始进行延伸反应，长时间稳定的逆转录反应可合成完整的低丰度表达基因，合成长达20kb的cDNA,特别适用于全长cDNA文库制作、高质量全长cDNA合成等。若使用Random hexamers 和Oligo (dT)23VN共同逆转录，短时高效逆转录反应得到的cDNA保证产量和各个位置效率的均一性，更适用于后续qPCR定量反应。
组分说明：
| 组 分 | R211-01 50 rxn (20 μl/rxn) | R211-02 100 rxn (20 μl/rxn) |
| RNase free ddH2O | 1 ml | 1 ml |
| 2 ×RT Mixa | 500 μl | 1 ml |
| HiScript® II Enzyme Mixb | 100 μl | 200 μl |
| Oligo（dT）23VN (50 μM) | 50 μl | 100 μl |
| Random hexamers (50 ng/μl) | 50 μl | 100 μl |
a. 包含1 mM dNTP
b. 包含RNase inhibitor
贮藏条件: -20℃。
质量控制
所有组分经检测均无核酸外切酶、核酸内切酶及RNase残留。
功能检测1：逆转录体系中加入200 U本酶，以1 μg HeLa细胞总RNA为模板，Oligo (dT)23VN为引物，50℃反应45 min。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增HERC1基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的15.1 kb条带。
功能检测2：逆转录体系中加入200 U本酶，以1 pg HeLa细胞总RNA为模板，Oligo (dT)23VN为引物，50℃反应30 min。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增GAPDH基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的550 bp条带。
功能检测3：以500 ng HeLa细胞总RNA为模板，以Oligo (dT)23VN为引物，55℃反应45 min。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增Polε基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的7.1 kb (GC-rich)条带。
功能检测4：以1 pg-1 µg HeLa细胞总RNA为模板，以Random hexamers为引物，qRT-PCR测试高中低三种丰度七个基因表达。以6个数量级模板量的对数值对CT值做标准曲线并计算扩增效率，R2>0.990，扩增效率在0.95到1.05之间。
注意事项
1.防止RNase污染 ：保持实验区域洁净;操作时需穿戴干净的手套、口罩;实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase free。
2.引物选择
（1）后续实验为PCR
· 如果模板为真核生物来源，一般情况下首选Oligo dT，与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
· 基因特异性引物(GSP)的特异性最高。当用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成时，可改用Oligo dT或Random hexamers重新进行逆转录。
· Random hexamers特异性最低，所有RNA，包括mRNA, rRNA, tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源时，使用Oligo dT或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成，可使用Random hexamers为引物。
(2)后续实验为qPCR
将Oligo（dT）23VN与Random hexamers等量混合使用，可使mRNA的各个区域均能以相同效率引发cDNA合成，有助于提高定量结果的重复性。
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