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HiScript® II Reverse Transcriptase
具有超强耐热性和延伸效率的新一代逆转录酶
• 反应温度42℃-55℃，50℃半衰期超过240分钟，55℃半衰期可达60分钟
• 可合成创纪录的20 kb全长cDNA
• 5分钟即可合成长达10 kb的cDNA，适合快速逆转录反应
• 更高的杂质耐受度
• 更高的检测灵敏度，分子诊断首选逆转录酶
图1. HiScript® II Reverse Transcriptase具有极高的热稳定性和极长的高温半衰期。
SS III: Superscript® III。
图2. HiScript® II Reverse Transcriptase对具有复杂结构的RNA模板有更高逆转录能力。
以1 μg HeLa细胞总RNA为模板，分别用HiScript® II Reverse Transcriptase和T品牌逆转录酶进行逆转录反应，时间设置为5 min。取1 μl cDNA为模板，用Vazyme LAmp® DNA Polymerase扩增具有高GC结构的FIB 6100 bp和Pole 7117 bp片段。
图3. HiScript® II Reverse Transcriptase具有宽广且灵敏的线性逆转录范围。
以1 μg- 1 pg HeLa细胞总RNA为模板，用HiScript® II Q RT SuperMix for qPCR (R222-01)做逆转录，取1 μl cDNA为模板，分别用AceQ® qPCR SYBR® Green Master Mix扩增B2M基因 (A) 和EGFR基因 (B)。
图4. HiScript® II Reverse Transcriptase可逆转录长达20 kb的RNA模板。
以1 μg HeLa细胞总RNA或小鼠骨骼肌细胞总RNA (for Nebulin)为模板，用HiScript® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (R211-01)进行逆转录。取1 μl cDNA为模板，用Vazyme LAmp® DNA Polymerase扩增。
M：DL15000 Marker.
图5. HiScript® II Reverse Transcriptase可快速逆转录较长RNA模板。
以1 μg HeLa细胞总RNA为模板，Oligo (dT)23 VN为引物，分别用HiScript® II Reverse Transcriptase或Superscript® III Reverse Transcriptase (SSIII)在50℃进行逆转录，反应时间设置为5、15、30、45分钟。取1 μl cDNA为模板，用Vazyme LAmp® DNA Polymerase扩增Fibrillin基因10.0 kb或6.1 kb片段。
M:DL15000 Marker.
在上一代的HiScript® Reverse Transcriptase的基础上，通过专利的体外分子进化技术，获得的全新逆转录酶突变体-HiScript® II Reverse Transcriptase。其携带的多个点突变使得其热稳定性大幅提高，在50℃的半衰期超过240分钟，并可在55℃长时间反应而保持稳定，保证了具有复杂二级结构模板的逆转录成功率。高温下保持的高活性能够带来更高的cDNA产量及灵敏度。同时，HiScript® II Reverse Transcriptase与模板的亲和力 (affinity)以及行进性 (processivity)大幅提高，表现为极强的cDNA持续合成能力。HiScript® II Reverse Transcriptase可从小鼠骨骼肌总RNA中逆转录获得创纪录的20.0 kb的cDNA ，并且5分钟内的合成长度可达10 kb，非常适合快速逆转录反应。HiScript® II Reverse Transcriptase对于常见的逆转录抑制剂具有更好的耐受度。（这些抑制剂通常是RNA提取试剂的组分，或者是来源于样品，在提取过程中会有不同程度的残留，并在逆转录时被引入，如异硫氰酸胍、乙醇、木聚糖、EDTA、SDS、CTAB）。与野生型的M-MLV (H-)以及其它逆转录酶相比，HiScript® II Reverse Transcriptase的杂质耐受度更高。这对于来源复杂的样品 (如FFPE组织)，或者富含多糖多酚的植物样品来说尤为重要。
组分说明：
| 组分 | R201-01 （2000 U） | R201-01 （10000 U） |
| 5×HiScript® II Buffer | 500 μl | 500 μl |
| HiScript® II Reverse Transcriptase (200 U/μl) | 10 μl | 50 μl |
贮藏条件: -20℃。
质量控制
核酸外切酶残留检测：2000 U的本酶和50 μM 3‘和5’突出退火双链产物在37℃下孵育16 h，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：2000 U的本酶和0.3 μg质粒A在37℃下孵育4 h，DNA的电泳谱带不发生变化。
RNase残留检测：2000 U的本酶和1 μg HeLa细胞总RNA在37℃下孵育30 min，RNA电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌DNA残留检测：200 U本品中残留的核酸经E.coli gDNA特异性的TaqMan探针qPCR检测，E.coli基因组残留低于10拷贝。
功能检测1：逆转录体系中加入200 U本酶，以1 μg HeLa细胞总RNA为模板，Oligo (dT)23为引物，42℃反应45 min。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增VIN基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的4.6 kb条带。
功能检测2：逆转录体系中加入200 U本酶，以1 pg HeLa细胞总RNA为模板，Oligo (dT)23为引物，50℃反应30 min。取1/10 cDNA产物
进行PCR扩增GAPDH基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的550 bp条带。
功能检测3：以500 ng HeLa细胞总RNA为模板，以Oligo (dT)23VN为引物，55℃反应45 min。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增Polε基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的7.1 kb (GC-rich)条带。
注意事项：
1. 防止RNA酶污染
请保持实验区域洁净;操作时需穿戴干净的手套、口罩;实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证为RNase-free。
2. 引物选择
（1）后续实验为PCR
· 如果模板为真核生物来源，一般情况下首选Oligo dT，与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
· 基因特异性引物(GSP)的特异性最高。当用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成时，可改用Oligo dT或Random hexamers重新进行逆转录。
· Random hexamers特异性最低，所有RNA，包括mRNA, rRNA, tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源时，使用Oligo dT或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成，可使用Random hexamers为引物。
(2)后续实验为qPCR
将Oligo dT与Random hexamers混合使用，可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同，有助于提高定量结果的真实性和重复性。
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