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HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit
高性价比cDNA一链合成试剂盒
• HiScript® Reverse Transcriptase提供可靠的逆转录表现
• 宽泛的模板量范围可成功逆转录从10 pg-5 μg总RNA
• 高效的合成能力：可合成长达10 kb的cDNA
• 针对不同下游应用可选择不同引物，合成的一链cDNA可广泛应用于分子克隆、杂交、PCR扩增及qPCR反应等
• 操作简便快捷
HiScript® Reverse Transcriptase是在M-MLV (Moloney Murine Leukemia virus) 基础上经过多点突变得到的新型逆转录酶。该酶能够有效合成长达10 kb的cDNA，适用于常规RNA、富含GC区域或具有复杂二级结构RNA模板的逆转录。HiScript® 一链cDNA合成试剂盒基于HiScript® Reverse Transcriptase，包含合成高质量第一链cDNA所需的所有成分，适合于后续的PCR、qPCR实验。
组分说明：
| 组 分 | R111-01 50 rxn (20 μl/rxn) | R111-02 100 rxn (20 μl/rxn) |
| RNase free ddH2O | 1 ml | 1 ml |
| 2 ×RT Mixa | 500 μl | 1 ml |
| HiScript® Enzyme Mixb | 100 μl | 200 μl |
| Oligo(dT)18 (50 μM) | 50 μl | 100 μl |
| Random hexamers (50 ng/μl) | 50 μl | 100 μl |
a. 包含1 mM each dNTP。
b. 包含RNase inhibitor、HiScript® Reverse Transcriptase.
贮藏条件: -20℃。
质量控制
核酸外切酶残留检测：2000 U的本酶和50 μM 3'和5'突出退火双链产物在37℃下孵育16 h，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：2000 U的本酶和0.3 μg质粒A在37℃下孵育4 h，DNA的电泳谱带不发生变化。
RNase残留检测：2000 U的本酶和1 μg HeLa细胞总RNA在37℃下孵育30 min，RNA电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌DNA残留检测：200 U本品中残留的核酸经E.coli gDNA特异性的TaqMan探针qPCR检测，E.coli基因组残留低于10拷贝。
功能检测1：逆转录体系中加入200 U本酶，以1 μg HeLa细胞总RNA为模板，Oligo (dT)23为引物，42℃反应45 min。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增VIN基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的4.6 kb条带。
功能检测2：逆转录体系中加入200 U本酶，以1 pg HeLa细胞总RNA为模板，Oligo (dT)23为引物，50℃反应30 min。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增GAPDH基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的550 bp条带。
功能检测3：以500 ng HeLa细胞总RNA为模板，以Oligo (dT)23VN为引物，55℃反应45 min。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增Polε基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的7.1 kb (GC-rich)条带。
功能检测4：以1 pg-1 µg HeLa细胞总RNA为模板，以Oligo (dT)23VN和Random hexamers为引物，qRT-PCR测试高中低三种丰度七个基因表达。以6个数量级模板量的对数值对CT值做标准曲线并计算扩增效率，R2>0.990，扩增效率在0.95到1.05之间。
1. 防止RNA酶污染
请保持实验区域洁净;操作时需穿戴干净的手套、口罩;实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证为RNase-free。
2. 引物选择
（1）后续实验为PCR
· 如果模板为真核生物来源，一般情况下首选Oligo dT，与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
· 基因特异性引物(GSP)的特异性最高。当GSP无法有效引导第一链cDNA合成，可改用Oligo dT或Random hexamers重新进行逆转录。
· Random hexamers特异性最低，所有RNA，包括mRNA, rRNA, tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构、GC含量较高，或者模板为原核生物来源时，Oligo dT或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成，可使用Random hexamers为引物。
(2)后续实验为qPCR
将Oligo dT与Random hexamers混合使用，可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同，有助于提高定量结果的真实性和重复性。
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