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Hiscript Reverse Transcriptase
性能优化的逆转录酶
• 提高热稳定性，可耐受50℃的反应温度，适用于二级结构的RNA模板
• 增强与模板的亲和力，可获得更多全长的cDNA
• 高度灵敏，可检测到低至1 pg的总RNA
• 降低了逆转录过程的出错率，提高克隆的保真度
图1. HiScript® Reverse Transcriptase可逆转录低至1 pg总RNA用于PCR反应。
使用不同逆转录酶在50℃反应30分钟，将100 ng至1 pg小鼠肝脏总RNA 逆转录为cDNA。取1/10 cDNA为模板，用AceTaq® DNA Polymerase扩增β-Actin基因。NTC: no template control.
HiScript® Reverse Transcriptase是在M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase基础上经过多点突变得到的全新逆转录酶。HiScript® Reverse Transcriptase在50℃下活性最高，且可耐受高达55℃的反应温度，可用于具有二级结构的RNA模板的逆转录。增强与模板的亲和力，可获得更多全长的cDNA，并可检测到低至1 pg的总RNA，特别适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。此外HiScript® Reverse Transcriptase的错配率也比M-MLV (RNase H-) Reverse Transcriptase有所降低，提高了克隆的保真度。
组分说明：
| 组分 | R101-01 （2000 U） | R101-01 （10000 U） |
| 5×HiScript® Buffer | 500 μl | 500 μl |
| HiScript® Reverse Transcriptase (200U/μl) | 10 μl | 50 μl |
贮藏条件: -20℃保存。
质量控制
核酸外切酶残留检测：2000 U的本酶和50 μM 3’和5’突出退火双链产物在37℃下孵育16 h，DNA的电泳谱带不发生变化。
核酸内切酶残留检测：2000 U的本酶和0.3 μg质粒A在37℃下孵育4 h，DNA的电泳谱带不发生变化。
RNase残留检测：2000 U的本酶和1 μg HeLa细胞总RNA在37℃下孵育30 min，RNA电泳谱带不发生变化。
大肠杆菌DNA残留检测：200 U本品中残留的核酸经E.coli gDNA特异性的TaqMan探针qPCR检测，E.coli基因组残留低于10拷贝。
功能检测：逆转录体系中加入200 U本酶，以1 μg Hela细胞总RNA为模板，Oligo (dT)18为引物，42℃反应45 min。取1/10 cDNA产物进行PCR扩增VIN基因。琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的4.6 kb条带。
注意事项：
1. 防止RNA酶污染
请保持实验区域洁净;操作时需穿戴干净的手套、口罩;实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证为RNase-free。
2. 引物选择
（1）后续实验为PCR
· 如果模板为真核生物来源，一般情况下首选Oligo dT，与真核生物mRNA的3’Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。
· 基因特异性引物(GSP)的特异性最高。但有些情况下，用于PCR反应的GSP无法有效引导第一链cDNA合成。这时，可改用Oligo dT或Random hexamers重新进行逆转录。
· Random hexamers特异性最低，所有RNA，包括mRNA, rRNA, tRNA均可以作为Random hexamers的模板。当目标区域具有复杂二级结构或GC含量较高，或者模板为原核生物来源，使用Oligo dT或基因特异性引物(GSP)无法有效引导cDNA合成时，均可使用Random hexamers为引物。
(2)后续实验为qPCR
将Oligo dT与Random hexamers混合使用，可使mRNA的各个区域cDNA合成效率相同，有助于提高定量结果的真实性和重复性。
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