组分说明：

贮藏条件：4℃ 避光保存。

1.Q：RNA降解
 A.：（1）组织样本保存不当。RNA提取时要选新鲜组织或细胞样本，如果是冻存的样本尽量避免反复冻融。

（2）投入的样本较多，导致裂解不充分。

（3）提取RNA的试剂/器具存在RNase污染。RNA的降解通常发生在样品破碎/匀浆阶段，RNA提取是一个将样本破碎，匀浆，打破细胞结构，将RNA释放到液相体系中，再将其抽提出来的过程。样品离开活体/原来的生长环境后，样品中的内源RNase即会开始降解RNA，降解速度与内源RNase的含量及温度有关。

（4）RNA保存时间过久，发生降解。对提取的RNA进行纯度和完整度检测，分管在-80 ℃长期保存或在-20 ℃短期保存，尽快使用，避免反复冻融。

2. Q： 组织样本如何保存？

A：（1）方法一：组织离体后迅速投入液氮速冻，并用液氮保存。或待冻结后，转移至-80℃保存。

（2）方法二：将新鲜组织充分浸泡在RNA Keeper^® Tissue Stabilizer (R501-01)中，可在室温存放一周，4℃存放一个月，-20℃/-80℃长期保存。

  注意：不能直接将新鲜组织直接放入-80℃保存。样品的冻结会是一个缓慢的过程，在这个过程中，内源RNase会将RNA继续降解。

3. Q：在提取RNA时，如何避免基因组DNA污染？
A：向裂解液中加入氯仿后，需要在低温下(2-8℃)高速离心。离心后，RNA被抽提到上层的水相中，中、下层是有机相，含有氯仿。DNA即存在于中层，氯仿在常温下会与水以一定比例互溶，因此，常温离心会导致上层水相中也有少量基因组DNA污染。另外，吸取上层液体时，应非常小心，避免吸到中间层和下层。

4. Q：加入异丙醇离心后无沉淀。
A.：RNA浓度可能较低。建议加入异丙醇后在4℃或-20℃放置10-30分钟后再离  

心。若依然看不见沉淀，在弃上清的操作时，采用吸取而不是倾倒的方法，以免丢失沉淀。

5. Q：RT-PCR反应失败。
A：RT-PCR是多步反应，应首先检查反应体系（比如引物，程序等）。在确认PCR以及逆转录反应体系没有问题的情况下，RNA降解是导致实验失败的最主要的原因。RNA通常在提取过程中发生降解，并随着保存时间的延长，降解程度会不断增强。可以取少量新鲜提取或冻存的RNA跑1%琼脂糖凝胶电泳，检验完整性。以哺乳动物细胞/组织为例，完整的总RNA在胶上能看见清晰的三条带，分子量从大到小分别为28 s, 18 s, 5 s。若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即开始逆转录反应，并适量增大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则RNA已完全降解，需要重新提取。此外，RNA的纯度也会影响后续反应。RNA isolater^®基于异硫氰酸胍法，主要的杂质来自于异硫氰酸胍等盐的残留，对后续酶反应有很大的影响。因此需要用75%乙醇(用DEPC水配制)仔细洗涤沉淀(轻弹管底让沉淀悬浮，并静置数分钟)。