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miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix 125rxn(20μl/rxn)

价:
330.00
价:
¥0.00

号:MQ101-01

牌:Vazyme 诺唯赞

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miRNA Universal SYBR® qPCR Master Mix

miRNA荧光定量专用预混液

 

  • 超高的扩增特异性:基于化学法热启动的AceTaq® DNA Polymerase,95°C前完全封闭酶活,配以专利特异性促进因子Exactor,扩增更特异。
  • 优越的反应体系:最适的Buffer 组分及浓度,更适用于microRNA的逆转录及qPCR 实验。
  • 宽广的平台兼容:miRNA Universal SYBR® qPCR Master Mix中添加通用型ROX使得mix能够在兼容不同平台qPCR仪器,而无需进行ROX浓度调整。

 

超高的扩增特异性

                          

let7 家族成员序列极其相似,红色标出为差异的碱基。以合成的不同microRNA为模板,使用各成员引物进行交叉扩增。可见,当引物与模板完全匹配时,定量结果为100%;不完全匹配时,大多无法扩增。%相对检测值为所有不匹配和匹配的CT值的差值(%相对检测值= 2CT×100)。

 

优越的反应体系

                             

以Hela 细胞Total RNA为模板逆转录,扩增hsa-miR-15、hsa-miR-29、hsa-miR-155、hsa-miR-200基因;以小鼠肝脏组织Total RNA样本进行逆转录,扩增mmu-miR-16、mmu-miR-20、mmu-miR-21基因。结果显示,与同类产品相比,miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop) (# MR101)配套miRNA Universal SYBR® qPCR Master Mix (# MQ101)的反应体系,均有优异的表现。

 

宽广的平台兼容

           

在不同qPCR仪上扩增同一基因,在StepOnePlusTM、QuantStudio 3、CFX Connect均具有优秀的定量结果,说明MQ101能够兼容不同qPCR仪器平台,而无需进行ROX浓度调整。

 

本产品是使用SYBR® Green I嵌合荧光法进行miRNA定量反应的专用预混液。由于miRNA序列短,且同一家族的miRNA序列往往高度相近,故在定量时对特异性要求极高。本品基于化学法热启动的AceTaq® DNA Polymerase,配以优化的Buffer,能够极大地减少非特异性扩增;同时,特殊的ROX Reference Dye,使得预混液适应于所有qPCR仪器,无需在不同的仪器上调整ROX浓度,只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。推荐与本公司miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop) (Vazyme # MR101)配套使用。

 

组分

MQ101-01

(125 rxn / 20 μl reaction)

MQ101-02

 (500 rxn / 20μl reaction)

2 × miRNA Universal SYBR qPCR Master Mixa

1.25 ml

4 × 1.25 ml

mQ Primer R (10 μM) b

70 μl

250 μl

a.包含dNTP,Mg2+,AceTaq DNA Polymerase,SYBR Green I,Specific ROX Reference Dye等

b.序列为AGTGCAGGGTCCGAGGTATT

 

 

1 扩增曲线形状异常

①扩增曲线不光滑:信号太弱,经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。

②扩增曲线断裂或下滑:模板浓度较高,基线的终点值大于CT值。减小基线终点(CT值-4),重新分析数据。

③个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心,进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

 

2 反应结束无扩增曲线出现

①反应循环数不够:一般设置循环数为40,但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号,降低数据可信度。

②确认程序中是否设置了信号采集步骤:两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。

③确认引物是否降解:长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性,以排除其降解的可能。

④模板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

⑤模板降解:重新制备模板,重复实验。

 

3 CT值出现太晚

①扩增效率极低:优化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计合成引物。

②模板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

③模板降解:重新制备模板,重复实验。

④体系中存在PCR抑制剂:一般为模板带入,加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。

 

4 阴性对照出现明显扩增

①反应体系污染:更换新的Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。

②引物二聚体的出现:配合融解曲线进行分析。

 

5 绝对定量时标准曲线线性关系不佳

①加样误差:提高模板稀释倍数,提高加样体积。

②标准品降解:重新制备标准品,重复实验。

③模板浓度太高:提高模板稀释倍数。

 

6 融解曲线出现多峰

①引物设计不优:根据设计原则设计合成新的引物。

②引物浓度太高:适当降低引物浓度。

③cDNA模板带有基因组污染:重新制备cDNA模板。

 

7 实验重复性差

①加样体积失准:使用性能较好的移液枪;将模板做高倍稀释,以大体积加入反应体系中。

②定量PCR仪不同位置温度控制不一致:定期校准仪器。

③模板浓度太低:模板浓度越低,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。

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