ChamQTM Universal SYBR® qPCR Master Mix
通用型qPCR预混液
全平台通用
使用ChamQTM Universal SYBR® qPCR Master Mix(Vazyme #Q711)在不同类型的qPCR 仪(机型:StepOnePlus™、QuantStudio 3、CFX Connect )上扩增GAPDH 基因,定量结果优秀。说明Q711 预混液仪器适用性广,无需针对不同仪器调整ROX 浓度。
灵敏度与特异性的完美平衡
图A 是将pEMT 质粒进行8个10倍梯度稀释,图B 是根据图A 的CT 值得出的标准曲线。第8个梯度中质粒拷贝数浓度约为6 copies/ 4 μl,使用ChamQTM Universal SYBR® qPCR Master Mix(Vazyme #Q711)预混液对各稀释梯度中的pEMT 质粒进行检测,每孔模板使用量为4 μl。结果显示,Q711 预混液在宽广的模板量区间内具有优秀的线性关系,可以检测出个位数拷贝的待测模板,灵敏度极高。图C 是以HeLa 细胞cDNA 为模板,使用Vazyme #Q711 和Q311 预混液及市售其它品牌染料法qPCR 试剂(分别来自Supplier T、R、N),在相同条件下测试25 个随机挑选的基因,用以检测扩增特异性。统计结果显示:Q711 预混液能够完成超过96%(24/25)的目标基因检测,特异性极高。
稳健的重复性
以HeLa 细胞cDNA 为模板,使用Vazyme #Q711 预混液检测TBP 基因的表达,设置48 孔重复,用以检测扩增的稳
定性。可以看到,Q711 预混液的扩增重复性极好。
兼容标准程序与快速程序
使用Vazyme #Q711 预混液检测HeLa 细胞cDNA 样本(进行4个10 倍梯度的稀释)中TBP 基因( 扩增子长度:227 bp)的表达,分别选择标准程序和快速程序上机(机型:StepOnePlus™)。结果显示,Q711 预混液能够完美兼容标准与快速程序的定量检测。
本产品是使用SYBR® Green I嵌合荧光法进行qPCR反应的专用预混液。核心组分Champagne TaqTM DNA Polymerase为一种新型的抗体法热启动DNA聚合酶,具有特异性强、检测灵敏度高等诸多优点,配以针对qPCR优化的最适Buffer以及专利特异性促进因子ExactorTM,非常适合于进行高特异性、高灵敏度的qPCR反应。本产品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye,适应于所有qPCR仪器,无需在不同的仪器上调整ROX的浓度,只需在配制反应体系时加入引物和模板即可进行扩增。
1、扩增曲线形状异常
①扩增曲线不光滑:信号太弱,经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。
②扩增曲线断裂或下滑:模板浓度较高,基线的终点值大于CT值。减小基线终点(CT值-4),重新分析数据。
③个别扩增曲线突然骤降:反应管内留有气泡。处理样本时要注意离心,进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
2、反应结束无扩增曲线出现
①反应循环数不够:一般设置循环数为40,但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号,降低数据可信度。
②确认程序中是否设置了信号采集步骤:两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段;三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃
延伸阶段。
③确认引物是否降解:长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性,以排除其降解的可能。
④模板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
⑤模板降解:重新制备模板,重复实验。
3、CT值出现太晚
①扩增效率极低:优化反应条件,尝试三步法扩增程序,或者重新设计合成引物。
②模板浓度太低:减少稀释度重复实验,一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
③模板降解:重新制备模板,重复实验。
④PCR产物太长:推荐PCR产物长度为80 bp-150 bp。
⑤体系中存在PCR抑制剂:一般为模板带入,加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
4、阴性对照出现明显扩增
①反应体系污染:更换新的Mix、水、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。
②引物二聚体的出现:配合融解曲线进行分析。
5、绝对定量时标准曲线线性关系不佳
①加样误差:提高模板稀释倍数,提高加样体积。
②标准品降解:重新制备标准品,重复实验。
③模板浓度太高:提高模板稀释倍数。
6、融解曲线出现多峰
①引物设计不优:根据设计原则设计合成新的引物。
②引物浓度太高:适当降低引物浓度。
③cDNA模板带有基因组污染:重新制备cDNA模板。
7、实验重复性差
①加样体积失准:使用性能较好的移液枪;将模板做高倍稀释,以大体积加入反应体系中。
②定量PCR仪不同位置温度控制不一致:定期校准仪器。
③模板浓度太低:模板浓度越低,重复性越差,减少模板稀释度或提高加样体积。
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