常见问题及解决方案

1. 扩增曲线形状异常

a).扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生，提高模板浓度重复试验。

b).扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值。减小基线终点(Ct值- 4)，

重新分析数据。

c).个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。处理样本时要注意离心、进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

2. 反应结束无扩增曲线出现

a).反应循环数不够：一般设置循环数为40，但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度

b).确认程序中是否设置了信号采集步骤：两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。

c).确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除引物降解的可能性。

d).模板浓度太低：减少稀释度重复试验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

e).模板降解：重新制备模板，重复试验。

3. Ct值出现太晚

a).扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物

b).模板浓度太低：减少稀释度重复试验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。

c).模板降解：重新制备模板，重复试验。

d).PCR产物太长：一般将PCR产物长度设计为100 bp-150 bp之内。

e).反应体系中存在PCR反应抑制剂：一般为加入模板时带入，提高模板稀释倍数或者重新制备模板。

4 .阴性对照也出现明显扩增

a).反应体系或者水被污染：更换新的Mix或者水重复试验。反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。

b).引物二聚体的出现：一般在35循环以后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合融解曲线进行分析。

5. 绝对定量时标准曲线线性关系不佳

a).加样误差：加大模板稀释倍数，提高加样体积。

b).标准品降解：重新制备标准品，重复试验。

c).模板浓度太高：增加模板稀释倍数。

6. 融解曲线出现多峰

a).引物设计不够优化：根据设计原则设计新的引物。

b).引物浓度太高：适当降低引物浓度。

c).cDNA模板带有基因组污染：重新制备cDNA模板。

7. 实验重复性差

a).加样体积失准：使用性能较好的移液枪，扩大反应体积，将模板做高倍稀释，以大体积加入反应体系中。

b).定量PCR仪不同位置温度控制不一致：定期校准仪器。

c).模板浓度太低：模板浓度越稀，重复性越差，减少模板稀释度或提高加样体积。

8. 本产品是否可以4℃储存

a).不可以。4℃保存将会导致产品活性下降。

b).该产品-20℃保存可以长期保持活性，推荐-20℃保存。

c).因反复冻融也可能导致产品活性下降，因此当每次用量较小时，推荐小体积分装后-20℃保存。

9. 预变性时间

本产品基于的AceTaq® DNA Polymerase是化学修饰的热启动Taq酶，需要设置预变性温度为95℃，时间为至少5分钟，以充分释放酶活。如果模板的GC含量很高，可将预变性时间延长至10分钟。