◇植物细胞样本是否可以直接用本试剂盒进行扩增？

本方案中的细胞裂解方式不能有效裂解细胞壁，带有细胞壁的真核生物细胞需要在去除细胞壁之后再进行裂解，或者使用纯化后的RNA进行反应。

◇固定后的细胞是否本试剂盒进行扩增？

经过甲醛、丙酮等方法会使组织或细胞会使RNA的质量显著下降，导致扩增失败，因此本试剂盒不适应于固定过的细胞。

◇细胞是否可以不用PBS溶液清洗，直接用本试剂盒进行扩增？

对于培养的细胞，在实验前请测试并确认培养基对反应是否有抑制作用，可以用预计细胞样品携带的培养基加入到对照RNA中检测培养基是否抑制cDNA的合成。若培养液中不含对合成cDNA有抑制作用的成分，就可以直接吸取细胞样本。如无法确认培养基对反应的影响，建议将细胞重悬于PBS后再进行裂解与反应。其它类型的细胞请按上述操作测试细胞样品携带的组分是否抑制反应。

◇细胞样品取出后不能及时进行扩增，可以先保存起来吗？需要怎么处理？

如果需要储存一定时间后再进行反应，操作方案请参照09-1/第2、3步，制备好的细胞样品于-70°C或更低温度保存，取出后请立即进行扩增反应。分离得到的活细胞也可使用细胞冻存液冻存，在需要使用的时候复苏细胞，使用这种保存方案请在复苏后确认细胞是否存活，死亡的细胞会发生明显的RNA降解并导致反应失败。

◇PCR扩增全长cDNA时，如何确定循环数？

选择最佳的循环数确保扩增仍然在扩增的指数期，如果扩增循环数增加产量不再提升，说明反应已经达到了平台期。过度扩增的cDNA会导致cDNA文库质量下降。循环数过低，会导致cDNA产量下降。在产量足够的前提下循环数越少越好。为了确定最佳循环数，将待测样品分别做几个平行反应，每一个反应扩增不同的循环数。比如，可以设置三个反应，一个反应按照我们推荐的循环数进行扩增，另两个反应少2-3个循环数或者多2-3个循环数（例如，100个细胞分别用12、10和8各循环进行扩增）。

◇单细胞转录组扩增产量如何，扩增产物如何建库测序？

由于细胞的基因表达是瞬时变化的并与细胞类型、细胞活性、及细胞所周期的不同等因素都会显著影响最终的cDNA文库产出。一般情况下，Discover-sc^TM WTA Kit V2可以产生2-20 ng的cDNA产物。

建库推荐使用转座酶方式建库，使用1 ng cDNA扩增产物通过TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina^® (Vazyme #TD503)或者Nextera^® XT DNA Library Preparation Kit (Illumina #FC-131-1024)制备测序文库。