1、如果文库浓度过低，可以从哪些角度去寻找原因并如何改进？

以高质量的RNA样品为模板构建得到的文库浓度都能达到上机测序要求，如果无法提供合格的RNA样品，可尝试使用以下方法弥补：

◇起始量：提高样品起始量，最大可做到10 μg；

◇做几个重复的样品，到二链合成纯化步骤合并在一起，或做到PCR前合并在一起；

◇做不分选方案：94°C 8 min打断条件下RNA片段虽然偏小，但是分布会很集中，均一性也较好，有些个性化样品会出现打断不均一、某些大小的片段较多，经过PCR后更明显，出现刺峰，这种情况在不分选方案中出现很少。

2、文库定量常见问题

文库定量有两种方式：Qubit和qPCR分别测定文库质量浓度和文库摩尔浓度。其中由于qPCR利用成簇反应引物进行扩增定量，较为真实的反映出文库中可用于上机测序的DNA片段的数量，所以qPCR得到的文库定量结果较为可信。一般可同时使用两种方式定量文库，相互校正。

3、关于选择接头的说明

目前，该试剂盒适用接头分为两套组合：

组合一：VAHTSTM RNA Adapters set 1 - set 2 for Illumina® (Adapter 1-27, Vazyme#N803 、Vazyme #N804)共包括24个不同接头，分为两个单独包装，依序号各含有12个不同接头；

组合二：VAHTSTM RNA Adapters set 3 - set 6 for Illumina®(Adapter 1-96, Vazyme#N809、Vazyme #N810、Vazyme #N811、Vazyme #N812) 共包括96个不同接头，分为四个单独包装，依序号各含有24个不同接头；以上两套接头不可在同批测序样品中混合使用，可参考以下建议：

◇同批测序样品数＜24时，建议选择组合一；当样品数＜12时，可选择该组合的单独包装；

◇24＜同批测序样品数＜96时，建议选择组合二；也可根据具体样品数选择该组合的单独包装。

本试剂盒是否适合用于small RNA文库制备？

不适用。因为small RNA的长度仅为22 nt左右，而本试剂盒中磁珠抓取片段最低为100bp以上，无法有效富集到small RNA片段。

4、本试剂盒是否适用于非真核生物mRNA建库？

由于该试剂盒通过带有Oligo dT的磁珠直接抓取mRNA从而达到mRNA分离，因此不适用于非真核生物。

5、FFPE样本是否可以用该试剂盒建库？

FFPE样本中的mRNA会有一定降解，完整度较差，建议使用VAHTSTM Total RNA-seq(H/M/R) Library Prep Kit for Illumina®（Vazyme #NR603）试剂盒进行文库构建。

6、收到试剂盒后，误将NR1放置-20 ℃保存，是否还可以继续使用？

低温会破坏磁珠，不可再继续使用。可另行采购对应模块VAHTSTM mRNA CaptureBeads(Vazyme #N401)。

7、使用说明书方案进行分选，分选插入片段偏大，为什么？

使用磁珠分选过程中，磁珠未平衡至室温、未混匀、移液器不准、枪头挂壁严重等均会致使磁珠加入量少于规定值，导致所分选的插入片段偏大。

8、文库扩增最高可以使用多少循环？

可根据起始量来调整循环数；如果不确定，建议取1 ul进行Qubit检测后酌情再补1-2个循环，最多不超过17个循环。

9、文库进行Agilent 2100 Bioanalyzer质检，发现产生双峰，产生的原因？

◇RNA有杂质残留，建库过程中发生降解，到PCR步骤前的有效模板量低，PCR时由于模板不足发生了非特异性扩增。建议将RNA样品在65℃条件下加热15 min，检测是否降解，如果确实为RNA的问题则需要重新提取RNA。

◇物种本身比较特殊，RNA打断后片段不是连续且均一的分布，做分选方案时可能分选到了两个范围的片段。

◇特殊物种的mRNA丰度较低，PCR的有效模板较低。建议加大投入量或者做重复样品到二链合成后的纯化步骤合并在一起。

10、关于在进行Agilent 2100 Bioanalyzer、Qubit 及qPCR检测时，高产量文库出现过度扩增的解释。

高产量文库通常会出现不同程度的过度扩增现象。因为在文库扩增后期，通常引物被最先耗尽，大量文库片段在无法结合到引物的情况下，片段之间通过不完全匹配关系退火结合，从而形成部分双链+部分单链的杂合链，且片段更大。根据不同检测方式的对应原理，过度扩增产物在Agilent 2100 Bioanalyzer峰型中表现为upper marker之后有轻微翘尾；在Qubit 测定时，单链部分不计入有效浓度，但在qPCR过程单链能够被有效测定，因此表现为Qubit 测定浓度低于qPCR定量浓度约10%-50%，但以上现象均属正常，不影响文库测序和数据分析。