所需材料:
10ul,100-200ul以及多通道移液器
96孔培养板
CO2培养箱
带有450nm滤光片的酶标仪
使用方法:
制作标准曲线
1. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量,然后接种细胞。
2. 按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3-5个细胞浓度梯度,每组3-6个复孔。
3. 接种后培养2-4小时使细胞贴壁,然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定OD值,制作出一条以细胞数量为横坐标,OD值为纵坐标的标准曲线,根据此标准线可以测定未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提条件是实验的条件一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间)。
细胞活性检测
1. 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,96孔板每孔加入100ul,使待测细胞调密度至(1000-10000)/孔。
2. 5%CO2,37℃培养细胞24小时(培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异)。
3. 每孔加入10ul CCK-8溶液。如果起始的培养体积为200ul,则需加入20ul CCK-8溶液,其它情况以此类推。
4. 在细胞培养箱内继续孵育0.5-4小时,对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定(一般情况下,白细胞较难显色,因此需要较长的CCK- 8反应时间或增加细胞数量。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于贴壁细胞,CCK- 8的培养时间一般为1- 4小时,注意:CCK- 8的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准)。初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测,然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。
5. 在450nm测定吸光度。
细胞增殖-毒性检测
1. 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,96孔板每孔加入100ul,使待测细胞调密度至(1000-10000)/孔。
2. 5%CO2,37℃培养细胞24小时(培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异)。
3. 加入10ul不同浓度的待测物质,将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如6,12, 24或48小时)。
4. 每孔加入10ul CCK-8溶液。如果起始的培养体积为200ul,则需加入20ul CCK-8溶液,其它情况以此类推。
5. 在细胞培养箱内继续孵育0.5-4小时,对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定(一般情况下,白细胞较难显色,因此需要较长的CCK- 8反应时间或增加细胞数量。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色。对于贴壁细胞,CCK- 8的培养时间一般为1- 4小时,注意:CCK- 8的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准)。初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测,然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。
6. 在450nm测定吸光度。
注意:如果待测物质有氧化还原性,可在加CCK-8之前更换新鲜的培养基,去掉待测物质的影响。
计算公式:
细胞存活率= [(实验孔-空白孔) / (对照孔-空白孔)]×100%
抑制率= [(对照孔-实验孔) / (对照孔-空白孔)]×100%
实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质)
对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测物质)
空白孔(不含细胞和待测物质的培养基、CCK-8)
疑难解答:
每孔接种多少细胞 | 贴壁细胞每孔至少需要接种1000个细胞,检测白细胞时由于它的灵敏度较低,每孔至少需要接种2500个细胞,建议先做几个孔摸索接种细胞的数量(一般每孔接种细胞为1000-10000个之间)。 |
OD值太低怎们办 | 可以适当增加细胞数量,延长加入CCK- 8试剂后的染色时间 |
药物对测定有影响,如何解决 | 可在加CCK-8之前更换新鲜培养基,去掉药物的影响 |
如何设定空白对照 | 在不含细胞的培养基中加入CCK-8,即为空白对照,在做加药实验时,在不含细胞的培养基中加入CCK-8和药物,即为空白对照 |
那些物质对CCK-8有影响 | 氧化还原性物质 |
CCK-8对细胞毒性大小如何 | CCK-8对细胞的毒性非常低 |
没有450nm的滤光片怎么办 | 可以使用420-480nm的滤光片 |
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