Product Brief

Instructions

1.在室温或不超过37℃的水浴中溶解SDS-PAGE上样缓冲液(1X)。水浴溶解后立即室温存放，尽量避免长时间 置于水浴中。 
2.对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升SDS-PAGE上样缓冲液(1X)的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使SDS-PAGE上样缓冲液(1X)和细胞充分接触。通常SDS-PAGE上样缓冲液(1X)接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。裂解后的样品收集到一洁净离心管内。
3.对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升SDS-PAGE上样缓冲液(1X)的比例加入SDS-PAGE上样缓冲液(1X)。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再进行裂解。
4.对于组织样品：
A.把组织剪切成细小的碎片。
B.按照每20毫克组织加入150-250微升SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)的比例加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)。(如果裂解不充分可以适当添加更多的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)的用量。)
C.用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。
D.充分裂解后，将样品收集到一洁净离心管内。
说明：如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。
5.100℃或沸水浴加热5-10分钟，以充分变性蛋白。说明：煮沸前通常会发现蛋白样品内有粘稠的半透明状物体，通常在本上样缓冲液内沸水浴煮沸8-10分钟后可以确保该粘稠的半透明状物体消失，以便于后续的上样操作。
注意：如果起始时细胞或组织的用量较大，基因组DNA含量较高，煮沸5-10分钟后有可能仍然比较粘稠或者有粘稠状的半透明物体。此时需要再煮沸5-10分钟或者加入适量1X的蛋白上样缓冲液后再煮沸3-5分钟。充分煮沸后一方面可以使结合在基因组DNA上的蛋白充分释放，同时会导致基因组DNA的部分断裂从而使粘稠感消失，这样就不会影响后续的上样操作了。
6.冷却到室温后，室温稍离心一下以沉淀可能出现的杂质等，上清即可直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。通常电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。