材料需求 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 2ml离心管 组织研磨器 能达到10000g的离心机 细胞刮 |
---|
对于细胞:
注意:取适当量的裂解液,放与4℃预冷,使用前数分钟内需加入酶抑制剂。
1. 贴壁细胞,细胞刮刮下细胞,计数,并收集5×106 个细胞,600g 离心5分钟,尽量吸尽上清,用预冷的PBS重悬细胞,600g 离心5分钟收集细胞,尽量吸尽上清,加入0.5ml的预冷的裂解液,用移液器吹打数下,冰上孵育30分钟, 10000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。
注意:可以直接将裂解液加入培养细胞的器皿中裂解细胞,具体操作如下,
A.用移液枪小心吸去培养液,
B.加入适量的预冷的PBS,
C.用移液枪小心吸去PBS,
D.按照下表加入裂解液,冰上孵育30分钟。
E.将裂解液转入离心管中, 10000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。
板规格/表面积 | 试剂用量 |
100mm | 500~1000ul |
60mm | 250~500ul |
6-well plate | 200~400ul per well |
24-well plate | 100~200ul per well |
96-well plate | 50~100ul per well |
2.悬浮细胞,计数,并收集5×106 个细胞,600g 离心5分钟,尽量吸尽上清,用预冷的PBS重悬细胞,600g 离心5分钟收集细胞,尽量吸尽上清,加入0.5ml的预冷的裂解液,用移液器吹打数下,冰上孵育30分钟, 10000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。
对于组织:
注意:取适当量的裂解液,放与4℃预冷,使用前数分钟内需加入酶抑制剂。
1. 手术切除的组织块迅速置于预冷的生理盐水中,漂洗数次,洗净组织血迹,用滤纸吸干组织表面液体,将组织切成几个较小的组织块。
2. 称量组织,按组织净重(g):裂解液(ml)=1:10的比例,加入相应体积的裂解液进行匀浆 ,(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量)。
3. 匀浆器匀浆,肉眼观察无明显组织块,冰上孵育30分钟。
4. 10000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。
结果实例:
M N M N M N
DSG3 HSP90 PCNA
M:Hela Cells N:A549 Cells
如图:增强型RIPA裂解液提取细胞蛋白,BCA测定蛋白浓度,上样20ug,电泳,转膜,孵育博士德一抗,应用博士德ECL发光液显色。
故障排除:
问题 | 原因 | 解决办法 |
总蛋白量低 | 有些细胞较难裂解 | 确保细胞沉淀完全悬浮在增强型RIPA缓冲液中并孵化更长的时间,超声波处理以增加产量 |
蛋白浓度低 | 裂解液用量多 | 减少裂解液的用量 |
蛋白水解 | 没有加入蛋白酶抑制剂 | 加入蛋白酶抑制剂 |
磷酸化蛋白量少 | 磷酸酶活性高 | 加入磷酸酶抑制剂 |
温馨提示:因厂家更改产品包装、产地或者更换随机附件等没有任何提前通知,且每位咨询者购买情况、提问时间等不同,为此以下回复仅对提问者3天内有效,其他网友仅供参考!若由此给您带来不便请多多谅解,谢谢!
服务热线
0771-3293894