产品描述 | 对于5×10^6个细胞的抽提样品,本样品可以抽提200次,本产品可在60分钟的时间内完成蛋白的提取。 |
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需要材料 | 蛋白酶和磷酸酶抑制 剂2ml离心管 能达到10000g的离心机 细胞刮 |
注意事项:
1.温和的除垢剂裂解,产生的抽提物直接与BCA蛋白定量分析试剂或SDS-PAGE兼容。
2.抽提的可溶性蛋白处于非变性状态,可直接用于免疫沉淀反应和其他亲和纯化过程。
3.可透析,确保其与随后的分析系统兼容。
4.贴壁细胞可直接在板上裂解。
5.试剂已在几种不同类型的细胞系上进行了测试,包括COS-7,NIH3T3,Hepa1-6,293T,CHO等细胞。
6.蛋白质提取效率通常比冻融法和超声波法高。
7.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
使用方法:
注意:取适当量的裂解液,放与4℃预冷,使用前数分钟内需加入酶抑制剂。
1.对于贴壁细胞,细胞刮刮下细胞,计数,并收集5×106 个细胞,600g 离心5分钟,尽量吸尽上清,用预冷的PBS重悬细胞,600g 离心分钟收集细胞,尽量吸尽上清,加入0.5ml的预冷的裂解液,用移液器吹打数下,冰上孵育30分钟, 10000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。
注意:可以直接将裂解液加入培养细胞的器皿中裂解细胞,具体操作如下,
A.用移液枪小心吸去培养液,
B.加入适量的预冷的PBS,
C.用移液枪小心吸去PBS,
D.按照下表加入裂解液,4℃孵育30分钟。
E.将裂解液转入离心管中, 10000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。
板规格/表面积 | 试剂用量 |
100mm | 500~1000ul |
60mm | 250~500ul |
6-well plate | 200~400ul per well |
24-well plate | 100~200ul per well |
96-well plate | 50~100ul per well |
2.对于悬浮细胞,计数,并收集5×106 个细胞,600g 离心5分钟,尽量吸尽上清,用预冷的PBS重悬细胞,600g 离心5分钟,尽量吸尽上清,加入0.5ml的预冷的裂解液,用移液器吹打数下,冰上孵育30分钟, 10000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。
常见问题:
问题 | 原因 | 解决方法 |
低蛋白的产出 | 蛋白表达低 | 转染步骤再优化 |
试剂量不足 | 加入更多试剂 | |
试剂不能渗透细胞膜 | 增加抽提时间,在抽提时摇动用力些 |
结果实例1:
如图:细胞提取试剂提取不同细胞的蛋白,BCA测定蛋白浓度,上样20ug,跑胶,转膜,孵育博士德一抗,使用博士德发光显色液显影。
结果实例2:
依照本说明书操作,使用不同细胞得到的蛋白量。
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