Product Brief

Instructions

注意事项：

1.为获得最佳效果，在破碎和增溶缓冲液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂。

2.所有试剂需预冷后使用,以保证蛋白的完整性。

3.蛋白增溶缓冲液在低温下为浑浊状态，请于此温度下混匀后吸取加入样本中。

4.对于提取的膜蛋白，建议使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行定量。

5.如果膜蛋白部分中的洗涤剂干扰下游应用，可以减少样品中的洗涤剂含量，去除量需要凭经验确定。

6.因为除去过多的洗涤剂可能导致蛋白质沉淀。

7.两部分都与SDS-PAGE相容。

8.本产品适用于哺乳动物细胞和组织。

需要材料：

蛋白酶和磷酸酶抑制剂

恒温水浴锅

2ml离心管

组织匀浆器

超声仪

涡旋混合器

细胞刮

能达到16000g的离心机

使用方法：

注意：抽提蛋白前，将细胞破碎缓冲液和蛋白增溶缓冲液置于冰上预冷，在使用前数分钟内加入酶抑制剂。

细胞：

1.对于贴壁细胞：细胞刮刮下细胞，计数，并收集5×106 个细胞，600g 离心5分钟，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备用。

2.对于悬浮细胞：计数，并收集5×106 个细胞，600g 离心5分钟，尽量吸尽上清，留下细胞沉淀备。

3.用适量预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，600g离心5分钟沉淀细胞，弃上清。

4.加入0.5ml的预冷的细胞破碎缓冲液，混匀，转入预冷的离心管，在冰上孵育15分钟，定期混合悬浮液30秒（3到4次）。

5.用超声波探头超声处理悬浮液，破碎细胞并碎片化基因组DNA。在超声处理过程中，必须小心操作以防止样品发热。超声破碎30-40秒，直到裂解完成（通常3-4次）。在每次超声处理之间，将悬浮液在冰上冷冻1分钟。

6.添加0.5ml预冷的蛋白增溶缓冲液，混匀，冰上孵育10分钟，定期混合悬浮液60秒（4到5次），在每个涡旋步骤之间将管保持在冰水浴中30-60秒。

7.将离心管转移到37℃水浴中孵育30分钟，定期混合悬浮液30秒（3到4次）。

8.在离心机中以16000g室温离心5分钟，仔细观察会有两相，将上层亲水相转移至一新的离心管中。

9.将0.5ml的蛋白增溶缓冲液加入到底部疏水相的管中，重复第6步到第8步。

10.合并两次收集的上层亲水相，此为胞浆蛋白，可以保存在-80℃以备日后使用。

11.收集底部疏水相并转移到新的离心管中，可以保存在-80℃以备日后使用。

12.底部碎片请将其取出，留待以后分析或丢弃。

注意：如果不能立即进行下游应用，亲水相和疏水相蛋白应快速冷冻，然后储存在-80℃。此外，为了避免样品反复冻融，可分装保存使用。

组织：

1.准备50mg的组织块，迅速置于预冷的PBS中，漂洗数次，将组织切成几个较小的组织块，放入组织匀浆器中。

2.加入预冷的细胞破碎缓冲液0.5ml,至于冰上匀浆，直至获得均匀的悬浮液，转入预冷的离心管。

3.在冰上孵育15分钟，定期混合悬浮液30秒（3到4次）。

4.用超声波探头超声处理悬浮液，破碎细胞并碎片化基因组DNA。在超声处理过程中，必须小心操作以防止样品发热。超声破碎30-40秒，直到裂解完成（通常3-4次）。在每次超声处理之间，将悬浮液在冰上冷冻1分钟。

5.添加0.5ml预冷的蛋白增溶缓冲液，混匀，冰上孵育10分钟，定期混合悬浮液60秒（4到5次），在每个涡旋步骤之间将管保持在冰水浴中30-60秒。

6.将离心管转移到37℃水浴中孵育30分钟，定期混合悬浮液30秒（3到4次）。

7.在离心机中以16000g室温离心5分钟，仔细观察会有两相，将上层亲水相转移至一新的离心管中。

8.将0.5ml蛋白增溶缓冲液加入到底部疏水相的管中，重复第6步到第8步。

9.合并两次收集的上层亲水相，此为胞浆蛋白，可以保存在-80℃以备日后使用。

10.收集底部疏水相并转移到新的离心管中，可以保存在-80℃以备日后使用。

11.底部碎片请将其取出，留待以后分析或丢弃。

注意：如果不能立即进行下游应用，亲水相和疏水相蛋白应快速冷冻，然后储存在-80℃。此外，为了避免样品反复冻融，可分装保存使用。

SDS-PAGE电泳操作步骤：

1.每100ul膜蛋白提取混合物加入0.9ml丙酮，冰浴20分钟，10000g离心20分钟。

2.弃上清，沉淀置冰上干燥10分钟(敞开离心管盖)，加入适当体积的上样缓冲液溶解，沸水浴5分钟，如还有难溶物，可取上清上样电泳，也可以加入一定量的Urea，Thiourea，NDSB-20等试剂有助于膜蛋白完全溶解。

结果实例1：

依照本说明书操作，5×106 个不同的细胞得到的膜蛋白的量，使用博士德的BCA蛋白浓度测定试剂盒测浓度得到

的蛋白量。

结果实例2：

应用本试剂盒从冷冻的小鼠肺和心肌提取膜蛋白，通过SDS-PAGE分离膜蛋白和胞质蛋白，上样10ug，并转移到NC膜上，孵育一抗，使用博士德发光底物生成图像。

博士德相关产品：

AR1182        广谱蛋白酶抑制剂

AR1183        广谱磷酸酶抑制剂

AR0146        BCA蛋白浓度测定试剂盒

AR0131        SDS-PAGE蛋白上样缓冲液2X(变性)

故障排除：