材料需要:蛋白酶和磷酸酶抑制剂
2ml离心管
组织研磨器
能达到13000g的离心机
注意事项:
1.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。
2.裂解得到的蛋白样品,含有较高浓度的去垢剂干扰,不建议用Bradford 法测定蛋白浓度,可以选用BCA蛋白定量试剂盒(博士德产品货号为AR0146,AR1110)测定蛋白浓度。
3.本试剂能提取大部分经常研究的蛋白质抗原,但对于大分子多聚抗原则无效。
使用方法:
取适量裂解液,在使用前数分钟内加入酶抑制剂。
对于细胞样品:
1.对于贴壁细胞,培养好的细胞吸去培养液后,加入预冷的PBS洗两次,加入适量提取试剂(试剂用量见下表格),用移液器吹打数下,把细胞吹散,冰上裂解10分钟。充分裂解后,将裂解物移入预冷的微型离心管中,4℃,13000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。
板规格/表面积 | 试剂用量 |
100×100mm | 500~1000ul |
100×60mm | 250~500ul |
6-well plate | 200~400ul per well |
24-well plate | 100~200ul per well |
2.对于悬浮细胞,离心(1000g,5min)收集细胞,用预冷的PBS洗两次,离心(1000g,5min),收集细胞,,加入适量裂解液, 每100万个细胞加入100ul的裂解液。用移液器吹打数下,把细胞吹散,冰上裂解10分钟,期间拿出涡旋震荡数次,充分裂解细胞。充分裂解后,4℃,13000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。
对于组织样品:
1.把组织剪切成细小的碎片。
2.按照每0.1g组织加入1ml裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。)
3.用玻璃匀浆器匀浆,冰上裂解10分钟,直至充分裂解。
4.充分裂解后,13000g离心10分钟,取上清,即为蛋白提取物。
故障排除:
问题 | 可能原因 | 解决办法 |
蛋白总含量低 | 一些细胞比其他细胞更难溶解 | 充分悬浮细胞沉淀,延长裂解时间,增加涡旋振荡次数 |
蛋白浓度低 | 加入过多的裂解缓冲液 | 减少裂解缓冲液的用量 |
蛋白水解 | 没有加入蛋白酶抑制剂 | 加入蛋白酶抑制剂 |
没有磷酸化蛋白 | 没有加入磷酸酶抑制剂 | 加入磷酸酶抑制剂 |
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